ප්‍රතිශක්තිකරණ පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය පිළිකා ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ (TME) ප්‍රධාන ලක්ෂණයකි, නමුත් ව්‍යතිරේක කිහිපයක් හැර, ඒවායේ අනන්‍යතා බොහෝ දුරට නොදන්නා කරුණකි. මෙහිදී, මෙම විවිධ TME මැදිරිවල පරිවෘත්තීය හෙළි කිරීම සඳහා අපි ඉහළ ශ්‍රේණියේ සේරස් පිළිකා (HGSC) ඇති රෝගීන්ගේ පිළිකා සහ ඇස්කයිට් වලින් පිළිකා සහ T සෛල විශ්ලේෂණය කළෙමු. ඇස්කයිට් සහ පිළිකා සෛල පුළුල් පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් ඇත. ඇස්කයිට් සමඟ සසඳන විට, පිළිකා-ආක්‍රමණය කරන T සෛල 1-මෙතිල්නිකොටිනමයිඩ් (MNA) වලින් සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් වේ. T සෛලවල MNA මට්ටම ඉහළ ගොස් ඇතත්, නිකොටිනමයිඩ් N-මෙතිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස් (S-adenosylmethionine සිට nicotinamide දක්වා මෙතිල් කාණ්ඩ මාරු කිරීම උත්ප්‍රේරණය කරන එන්සයිමයක්) ප්‍රකාශනය ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් සහ පිළිකා සෛල වලට සීමා වේ. ක්‍රියාකාරීව, MNA පිළිකා ප්‍රවර්ධනය කරන සයිටොකයින් පිළිකා නෙරෝසිස් සාධකය ඇල්ෆා ස්‍රාවය කිරීමට T සෛල ප්‍රේරණය කරයි. එබැවින්, TME-ව්‍යුත්පන්න MNA T සෛලවල ප්‍රතිශක්තිකරණ නියාමනයට දායක වන අතර මිනිස් පිළිකා සඳහා ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා විභව ප්‍රතිශක්තිකරණ ඉලක්කයක් නියෝජනය කරයි.
පිළිකාවෙන් ලබාගත් පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය පිළිකා නාශක ප්‍රතිශක්තිය කෙරෙහි ප්‍රබල නිෂේධනීය බලපෑමක් ඇති කළ හැකි අතර, රෝග ප්‍රගතිය සඳහා ප්‍රධාන ගාමක බලවේගයක් ලෙසද ඒවා ක්‍රියා කළ හැකි බවට වැඩි වැඩියෙන් සාක්ෂි පෙන්නුම් කරයි (1). වෝර්බර්ග් ආචරණයට අමතරව, පිළිකා සෛලවල පරිවෘත්තීය තත්ත්වය සහ පිළිකා ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ (TME) ප්‍රතිශක්තිකරණ තත්ත්වය සමඟ එහි සම්බන්ධතාවය සංලක්ෂිත කිරීමට මෑත කාලීන කටයුතු ආරම්භ කර ඇත. මීයන් ආකෘති සහ මානව T සෛල පිළිබඳ අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ග්ලූටමින් පරිවෘත්තීය (2), ඔක්සිකාරක පරිවෘත්තීය (3) සහ ග්ලූකෝස් පරිවෘත්තීය (4) විවිධ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල උප කාණ්ඩ මත ස්වාධීනව ක්‍රියා කළ හැකි බවයි. මෙම මාර්ගවල පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය කිහිපයක් T සෛලවල පිළිකා නාශක ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වයි. ටෙට්‍රාහයිඩ්‍රොබයෝප්ටරින් (BH4) නම් කෝඑන්සයිම අවහිර කිරීම T සෛල ප්‍රගුණනයට හානි කළ හැකි බවත්, ශරීරයේ BH4 වැඩි වීම CD4 සහ CD8 මගින් මැදිහත් වන පිළිකා නාශක ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරය වැඩි දියුණු කළ හැකි බවත් ඔප්පු වී ඇත. ඊට අමතරව, BH4 (5) පරිපාලනය කිරීමෙන් කයිනුරේනීන් වල ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දන බලපෑම ගලවා ගත හැකිය. අයිසොසිට්‍රේට් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් (IDH) විකෘති ග්ලියෝබ්ලාස්ටෝමාවේදී, එනැන්ටියෝමෙටබොලික් (R)-2-හයිඩ්‍රොක්සිග්ලූටරේට් (R-2-HG) ස්‍රාවය කිරීම T සෛල සක්‍රිය කිරීම, ප්‍රගුණනය සහ සයිටොලිසිස් ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වයි (6). මෑතකදී, ග්ලයිකොලිසිස් හි අතුරු නිෂ්පාදනයක් වන මෙතිල්ග්ලියොක්සල්, මයිලෝයිඩ් සම්භවයක් ඇති මර්දන සෛල මගින් නිපදවන බවත්, මෙතිල්ග්ලියොක්සල් හි T සෛල හුවමාරුව මගින් ඵලදායි T සෛල ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වන බවත් පෙන්වා දී ඇත. ප්‍රතිකාරයේදී, මෙතිල්ග්ලියොක්සල් උදාසීන කිරීම මගින් මයිලෝයිඩ්-ව්‍යුත්පන්න මර්දන සෛල (MDSC) ක්‍රියාකාරිත්වය ජය ගත හැකි අතර මූසික ආකෘතිවල මුරපොල අවහිර කිරීමේ ප්‍රතිකාරය සහජීවනයෙන් වැඩි දියුණු කළ හැකිය (7). මෙම අධ්‍යයනයන් සාමූහිකව අවධාරණය කරන්නේ T සෛල ක්‍රියාකාරිත්වය සහ ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කිරීමේදී TME-ව්‍යුත්පන්න පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවල ප්‍රධාන කාර්යභාරයයි.
ඩිම්බකෝෂ පිළිකා වල T සෛල අක්‍රියතාව බහුලව වාර්තා වී ඇත (8). මෙය හයිපොක්සියා සහ අසාමාන්‍ය පිළිකා සනාල ක්‍රියාවලියට ආවේණික පරිවෘත්තීය ලක්ෂණ නිසා (9), ග්ලූකෝස් සහ ට්‍රිප්ටෝෆාන් ලැක්ටික් අම්ලය සහ කයිනුරීන් වැනි අතුරු නිෂ්පාදන බවට පරිවර්තනය වීමට හේතු වේ. අධික බාහිර සෛලීය ලැක්ටේට් ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-γ (IFN-γ) නිෂ්පාදනය අඩු කරන අතර මයිලෝසප්‍රෙසිව් උප කාණ්ඩවල වෙනස ඇති කරයි (10, 11). ට්‍රිප්ටෝෆාන් පරිභෝජනය සෘජුවම T සෛල ප්‍රගුණනය වළක්වන අතර T සෛල ප්‍රතිග්‍රාහක සංඥාකරණය වළක්වයි (12-14). මෙම නිරීක්ෂණ තිබියදීත්, ප්‍රතිශක්තිකරණ පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය වටා ඇති බොහෝ කාර්යයන් ප්‍රශස්තිකරණය කළ මාධ්‍ය භාවිතයෙන් විට්‍රෝ ටී සෛල සංස්කෘතිය තුළ සිදු කරන ලදී, නැතහොත් සජීවීව සමජාතීය මූසික ආකෘතිවලට සීමා විය, ඒ දෙකෙන් එකක්වත් මිනිස් පිළිකා සහ භෞතික විද්‍යාත්මක සාර්ව සහ ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ විෂමජාතීයතාවය සම්පූර්ණයෙන්ම පිළිබිඹු නොකරයි.
ඩිම්බකෝෂ පිළිකාවේ පොදු ලක්ෂණයක් වන්නේ පෙරිටෝනියල් පැතිරීම සහ ඇස්කයිට් පෙනුමයි. ඇස්කයිට් වල සෛල තරල සමුච්චය වීම දියුණු රෝග සහ දුර්වල පුරෝකථනය සමඟ සම්බන්ධ වේ (15). වාර්තාවලට අනුව, මෙම අද්විතීය මැදිරිය හයිපොක්සික් වන අතර, සනාල එන්ඩොතලියල් වර්ධන සාධකය (VEGF) සහ ඉන්ඩොලියමයින් 2,3-ඩයොක්සිජන්ස් (IDO) ඉහළ මට්ටමක පවතින අතර, T නියාමන සෛල සහ මයිලෝයිඩ් නිෂේධනීය සෛල මගින් ආක්‍රමණය කරනු ලැබේ (15-18). ඇස්කයිට් වල පරිවෘත්තීය පරිසරය පිළිකාවට වඩා වෙනස් විය හැකිය, එබැවින් පෙරිටෝනියල් අවකාශයේ T සෛල නැවත ක්‍රමලේඛනය කිරීම අපැහැදිලි ය. ඊට අමතරව, පිළිකා පරිසරයේ පවතින ඇස්කයිට් සහ පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය අතර ඇති ප්‍රධාන වෙනස්කම් සහ විෂමතාවය ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල ආක්‍රමණයට සහ පිළිකා මත ඒවායේ ක්‍රියාකාරිත්වයට බාධාවක් විය හැකි අතර, වැඩිදුර පර්යේෂණ අවශ්‍ය වේ.
මෙම ගැටළු විසඳීම සඳහා, අපි විවිධ සෛල වර්ග (CD4 + සහ CD8 + T සෛල ඇතුළුව) මෙන්ම පිළිකා තුළ සහ අතර අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා සංවේදී සෛල වෙන් කිරීම සහ ද්‍රව වර්ණදේහ ටැන්ඩම් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (LC-MS/MS) ක්‍රමයක් නිර්මාණය කළෙමු. එහි පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය රෝගියාගේ එකම ඇස්කයිට් සහ පිළිකා පරිසරයේ සෛල පුරා විහිදේ. මෙම ප්‍රධාන ජනගහනයේ පරිවෘත්තීය තත්ත්වය පිළිබඳ ඉහළ විභේදනයක් ලබා දීම සඳහා අපි මෙම ක්‍රමය ඉහළ මානයන් සහිත ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි සහ තනි සෛල RNA අනුක්‍රමණය (scRNA-seq) සමඟ ඒකාබද්ධව භාවිතා කරමු. මෙම ක්‍රමය පිළිකා T සෛලවල 1-මෙතිල්නිකොටිනමයිඩ් (MNA) මට්ටමේ සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් හෙළි කළ අතර, විට්‍රෝ අත්හදා බැලීම්වලින් පෙන්නුම් කළේ T සෛල ක්‍රියාකාරිත්වයට MNA හි ප්‍රතිශක්තිකරණ බලපෑම කලින් නොදන්නා බවයි. සාමාන්‍යයෙන්, මෙම ක්‍රමය පිළිකා සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල අතර අන්‍යෝන්‍ය පරිවෘත්තීය අන්තර්ක්‍රියා හෙළි කරන අතර, T සෛල පාදක ඩිම්බකෝෂ පිළිකා ප්‍රතිශක්ති චිකිත්සාව ප්‍රතිකාර අවස්ථා සඳහා ප්‍රතිකාර සඳහා ප්‍රයෝජනවත් විය හැකි ප්‍රතිශක්තිකරණ නියාමනය පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය පිළිබඳ අද්විතීය අවබෝධයක් ලබා දෙයි.
ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය එකවර ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා අපි ඉහළ මාන ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි භාවිතා කළෙමු [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) යනු ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල සහ පිළිකා සෛල ජනගහනය වෙන්කර හඳුනා ගන්නා සමාන්තර සාමාන්‍ය සලකුණු වේ (වගුව S2 සහ රූපය S1A). මෙම විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ T සෛල හා සසඳන විට, ඇස්කයිට් සහ පිළිකා සෛල ඉහළ ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය මට්ටම් ඇති නමුත් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයේ කුඩා වෙනස්කම් ඇති බවයි. පිළිකා සෛලවල සාමාන්‍ය ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T සෛලවල සාමාන්‍ය ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය මෙන් තුන් ගුණයක් හෝ හතර ගුණයක් වන අතර CD4 + T සෛලවල සාමාන්‍ය ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය CD8 + T සෛලවල 1.2 ගුණයක් වන අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ පිළිකා ආක්‍රමණය කරන ලිම්ෆොසයිට් (TIL) එකම TME තුළ පවා විවිධ පරිවෘත්තීය අවශ්‍යතා ඇති බවයි (රූපය 1A). ඊට වෙනස්ව, පිළිකා සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය CD4 + T සෛල වලට සමාන වන අතර, සෛල වර්ග දෙකෙහිම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය CD8 + T සෛල වලට වඩා වැඩිය (රූපය 1B). සාමාන්‍යයෙන්, මෙම ප්‍රතිඵල මගින් පරිවෘත්තීය මට්ටම හෙළි වේ. පිළිකා සෛලවල පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරිත්වය CD4 + T සෛල වලට වඩා ඉහළ අගයක් ගන්නා අතර, CD4 + T සෛලවල පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරිත්වය CD8 + T සෛල වලට වඩා ඉහළ අගයක් ගනී. සෛල වර්ග හරහා මෙම බලපෑම් තිබියදීත්, CD4 + සහ CD8 + T සෛලවල පරිවෘත්තීය තත්ත්වය හෝ පිළිකා සමඟ සසඳන විට ඇස්කයිට් වල ඒවායේ සාපේක්ෂ අනුපාතයන්හි ස්ථාවර වෙනසක් නොමැත (රූපය 1C). ඊට වෙනස්ව, CD45-සෛල භාගයේදී, පිළිකාවේ EpCAM+ සෛල අනුපාතය ඇස්කයිට් සමඟ සසඳන විට වැඩි විය (රූපය 1D). EpCAM+ සහ EpCAM- සෛල සංරචක අතර පැහැදිලි පරිවෘත්තීය වෙනසක් ද අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. EpCAM+ (පිළිකා) සෛල වලට EpCAM- සෛල වලට වඩා ඉහළ ග්ලූකෝස් අවශෝෂණයක් සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයක් ඇති අතර, එය TME හි පිළිකා සෛලවල ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් වල පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරිත්වයට වඩා බෙහෙවින් වැඩි ය (රූපය 1, E සහ F).
(A සහ B) ග්ලූකෝස් අවශෝෂණයේ මධ්‍ය ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය (MFI) (2-NBDG) (A) සහ CD4 + T සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය (Mifi) (MitoTracker තද රතු) (B) නියෝජිත ප්‍රස්ථාර (වමේ) සහ වගුගත දත්ත (දකුණේ), CD8 + T සෛල සහ ඇස්කයිට් සහ ගෙඩියෙන් EpCAM + CD45-ටියුමර් සෛල. (C) ඇස්කයිට් සහ ගෙඩියේ CD4 + සහ CD8 + සෛල (CD3 + T සෛලවල) අනුපාතය. (D) ඇස්කයිට් සහ ගෙඩියේ EpCAM + පිළිකා සෛලවල අනුපාතය (CD45−). (E සහ F) EpCAM + CD45-ටියුමර් සහ EpCAM-CD45-matrix ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය (2-NBDG) (E) සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය (MitoTracker තද රතු) (F) නියෝජිත ප්‍රස්ථාර (වමේ) සහ වගුගත දත්ත (දකුණේ) ඇස්කයිට් සහ පිළිකා සෛල. (G) ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මගින් CD25, CD137 සහ PD1 ප්‍රකාශනයේ නියෝජිත ප්‍රස්ථාර. (H සහ I) CD4 + T සෛල (H) සහ CD8 + T සෛල (I) මත CD25, CD137 සහ PD1 ප්‍රකාශනය. (J සහ K) CCR7 සහ CD45RO ප්‍රකාශනය මත පදනම් වූ Naive, මධ්‍යම මතකය (Tcm), effector (Teff) සහ effector මතකය (Tem) ෆීනෝටයිප්. ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වල CD4 + T සෛල (J) සහ CD8 + T සෛල (K) හි නියෝජිත රූප (වමේ) සහ වගු දත්ත (දකුණේ). යුගල කළ t-පරීක්ෂණය (*P<0.05, **P<0.01 සහ ***P<0.001) මගින් තීරණය කරන ලද P අගයන්. රේඛාව ගැලපෙන රෝගීන් නියෝජනය කරයි (n = 6). FMO, fluorescence minus one; MFI, මධ්‍ය ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය.
තවදුරටත් විශ්ලේෂණයෙන් ඉතා විසඳා ඇති T සෛල ෆීනෝටයිපික් තත්ත්වය අතර අනෙකුත් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය විය. පිළිකා වල සක්‍රිය (රූපය 1, G සිට I දක්වා) සහ ඵලදායි මතකය (රූපය 1, J සහ K) ඇස්කයිට් (CD3 + T සෛලවල අනුපාතය) වලට වඩා බොහෝ විට දක්නට ලැබේ. ඒ හා සමානව, සක්‍රිය කිරීමේ සලකුණු (CD25 සහ CD137) සහ ක්ෂය වීමේ සලකුණු [ක්‍රමලේඛිත සෛල මරණ ප්‍රෝටීන් 1 (PD1)] ප්‍රකාශනය මගින් ෆීනෝටයිප් විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ මෙම ජනගහනයේ පරිවෘත්තීය ලක්ෂණ වෙනස් වුවද (රූපය S1, B සිට E දක්වා), නමුත් අහිංසක, ඵලදායි හෝ මතක උප කුලක අතර සැලකිය යුතු පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් අඛණ්ඩව නිරීක්ෂණය නොවූ බවයි (රූපය S1, F සිට I දක්වා). සෛල ෆීනෝටයිප් ස්වයංක්‍රීයව පැවරීම සඳහා යන්ත්‍ර ඉගෙනුම් ක්‍රම භාවිතා කිරීමෙන් මෙම ප්‍රතිඵල තහවුරු කරන ලද අතර, එමඟින් රෝගියාගේ ඇස්කයිට් වල අස්ථි ඇටමිදුළු සෛල (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) විශාල සංඛ්‍යාවක් පවතින බව තවදුරටත් අනාවරණය විය (රූපය S2A). හඳුනාගත් සියලුම සෛල වර්ග අතරින්, මෙම මයිලෝයිඩ් සෛල ජනගහනය ඉහළම ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය පෙන්නුම් කළේය (රූපය S2, B සිට G දක්වා). මෙම ප්‍රතිඵල HGSC රෝගීන්ගේ ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වල දක්නට ලැබෙන බහු සෛල වර්ග අතර ප්‍රබල පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් ඉස්මතු කරයි.
TIL හි පරිවෘත්තීය ලක්ෂණ තේරුම් ගැනීමේ ප්‍රධාන අභියෝගය වන්නේ ප්‍රමාණවත් සංශුද්ධතාවයකින්, ගුණාත්මකභාවයකින් සහ ප්‍රමාණයකින් යුත් T සෛල සාම්පල පිළිකා වලින් හුදකලා කිරීමේ අවශ්‍යතාවයයි. ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මත පදනම් වූ වර්ග කිරීමේ සහ පබළු පොහොසත් කිරීමේ ක්‍රම සෛලීය පරිවෘත්තීය පැතිකඩවල වෙනස්කම් වලට හේතු විය හැකි බව මෑත අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත (22-24). මෙම ගැටළුව මඟහරවා ගැනීම සඳහා, LC-MS/MS මගින් විශ්ලේෂණය කිරීමට පෙර ශල්‍යකර්මයෙන් වෙන් කරන ලද මිනිස් ඩිම්බකෝෂ පිළිකාවෙන් TIL හුදකලා කර හුදකලා කිරීම සඳහා අපි පබළු පොහොසත් කිරීමේ ක්‍රමය ප්‍රශස්ත කළෙමු (ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රම බලන්න; රූපය 2A). පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් සඳහා මෙම ප්‍රොටෝකෝලයේ සමස්ත බලපෑම තක්සේරු කිරීම සඳහා, ඉහත පබළු වෙන් කිරීමේ පියවරෙන් පසු නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් විසින් සක්‍රිය කරන ලද T සෛලවල පරිවෘත්තීය පැතිකඩ, පබළු වෙන් නොකළ නමුත් අයිස් මත රැඳී ඇති සෛල සමඟ සංසන්දනය කළෙමු. මෙම තත්ත්ව පාලන විශ්ලේෂණයෙන් මෙම කොන්දේසි දෙක අතර ඉහළ සහසම්බන්ධයක් ඇති බව සොයා ගත් අතර, පරිවෘත්තීය 86 ක කාණ්ඩයේ තාක්ෂණික පුනරාවර්තන හැකියාව ඉහළ පුනරාවර්තන හැකියාවක් ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (රූපය 2B). එමනිසා, මෙම ක්‍රම මගින් සෛල වර්ග පොහොසත් කිරීමකට භාජනය වන සෛලවල නිවැරදි පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණයක් සිදු කළ හැකි අතර, එමඟින් HGSC හි නිශ්චිත පරිවෘත්තීය හඳුනා ගැනීම සඳහා පළමු අධි-විභේදන වේදිකාව සපයන අතර එමඟින් සෛල නිශ්චිතතාව පිළිබඳ ගැඹුරු අවබෝධයක් ලබා ගැනීමට මිනිසුන්ට හැකි වේ. ලිංගික පරිවෘත්තීය වැඩසටහන.
(A) චුම්භක පබළු පොහොසත් කිරීමේ ක්‍රමානුරූප සටහන. LC-MS/MS මගින් විශ්ලේෂණය කිරීමට පෙර, සෛල චුම්භක පබළු පොහොසත් කිරීමේ අඛණ්ඩ වට තුනකට භාජනය වනු ඇත හෝ අයිස් මත පවතිනු ඇත. (B) පරිවෘත්තීය බහුලතාවයට පොහොසත් කිරීමේ වර්ගයේ බලපෑම. එක් එක් පොහොසත් කිරීමේ වර්ගය සඳහා මිනුම් තුනක සාමාන්‍යය ± SE. අළු රේඛාව 1:1 සම්බන්ධතාවයක් නියෝජනය කරයි. අක්ෂ ලේබලයේ දක්වා ඇති නැවත නැවත මිනුම්වල අභ්‍යන්තර-පන්ති සහසම්බන්ධය (ICC). NAD, නිකොටිනාමයිඩ් ඇඩිනීන් ඩයිනියුක්ලියෝටයිඩ. (C) රෝගියාගේ පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණයේ වැඩ ප්‍රවාහයේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන. ඇස්කයිට් හෝ පිළිකා රෝගීන්ගෙන් එකතු කර ක්‍රියෝප්‍රෙසර්ව් කරනු ලැබේ. එක් එක් සාම්පලයෙන් කුඩා කොටසක් ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර, ඉතිරි සාම්පල CD4+, CD8+ සහ CD45- සෛල සඳහා පොහොසත් කිරීමේ වට තුනකට භාජනය විය. මෙම සෛල භාග LC-MS/MS භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. (D) ප්‍රමිතිගත පරිවෘත්තීය බහුලතාවයේ තාප සිතියම. ඩෙන්ඩ්‍රොග්‍රෑම් සාම්පල අතර යුක්ලීඩීය දුර පිළිබඳ වෝඩ්ගේ පොකුරු කිරීම නියෝජනය කරයි. (E) සාම්පල පරිවෘත්තීය සිතියමේ ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය (PCA), එක් එක් සාම්පලයේ අනුපිටපත් තුනක් පෙන්වයි, එකම රෝගියාගෙන් ලබාගත් සාම්පල රේඛාවකින් සම්බන්ධ කර ඇත. (F) රෝගියා මත කොන්දේසිගත කරන ලද සාම්පලයේ පරිවෘත්තීය පැතිකඩෙහි PCA (එනම්, අර්ධ අතිරික්තතාව භාවිතා කිරීම); සාම්පල වර්ගය උත්තල බඳ මගින් සීමා කර ඇත. PC1, ප්‍රධාන සංරචකය 1; PC2, ප්‍රධාන සංරචකය 2.
ඊළඟට, HGSC රෝගීන් හය දෙනෙකුගේ ප්‍රාථමික ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වල CD4 +, CD8 + සහ CD45-සෛල කොටස්වල පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය 99 ක් විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා අපි මෙම පොහොසත් කිරීමේ ක්‍රමය යෙදුවෙමු (රූපය 2C, රූපය S3A සහ වගුව S3 සහ S4). මුල් විශාල ජීව සෛල සාම්පලයෙන් 2% සිට 70% දක්වා උනන්දුවක් දක්වන ජනගහනයක් සිටින අතර, සෛල අනුපාතය රෝගීන් අතර බෙහෙවින් වෙනස් වේ. පබළු වෙන් කිරීමෙන් පසු, පොහොසත් කරන ලද උනන්දුවෙහි කොටස (CD4+, CD8+ හෝ CD45-) සාමාන්‍යයෙන් සාම්පලයේ ඇති සියලුම ජීව සෛල වලින් 85% කට වඩා වැඩිය. මෙම පොහොසත් කිරීමේ ක්‍රමය අපට මිනිස් පිළිකා පටක පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියෙන් සෛල ජනගහනය විශ්ලේෂණය කිරීමට ඉඩ සලසයි, එය විශාල සාම්පල වලින් කළ නොහැක. මෙම ප්‍රොටෝකෝලය භාවිතා කරමින්, අපි තීරණය කළේ l-kynurenine සහ adenosine, මෙම හොඳින් සංලක්ෂිත ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දන පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය දෙක වන පිළිකා T සෛල හෝ පිළිකා සෛල තුළ ඉහළ ගොස් ඇති බවයි (රූපය S3, B සහ C). එමනිසා, මෙම ප්‍රතිඵල මගින් රෝගී පටකවල ජීව විද්‍යාත්මකව වැදගත් පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය සොයා ගැනීමට අපගේ සෛල වෙන් කිරීමේ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂමිතික තාක්ෂණයේ විශ්වාසවන්තභාවය සහ හැකියාව පෙන්නුම් කරයි.
අපගේ විශ්ලේෂණයෙන් රෝගීන් තුළ සහ රෝගීන් අතර සෛල වර්ගවල ප්‍රබල පරිවෘත්තීය වෙන්වීමක් ද අනාවරණය විය (රූපය 2D සහ රූපය S4A). විශේෂයෙන්, අනෙකුත් රෝගීන් හා සසඳන විට, රෝගියා 70 විවිධ පරිවෘත්තීය ලක්ෂණ පෙන්නුම් කළේය (රූපය 2E සහ රූපය S4B), රෝගීන් අතර සැලකිය යුතු පරිවෘත්තීය විෂමතාවයක් තිබිය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි. අනෙකුත් රෝගීන් හා සසඳන විට (ලීටර් 1.2 සිට 2 දක්වා; වගුව S1), රෝගියා 70 (මිලි ලීටර් 80) තුළ එකතු කරන ලද මුළු ඇස්කයිට් ප්‍රමාණය කුඩා බව සඳහන් කිරීම වටී. ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය අතරතුර අන්තර්-රෝගී විෂමතාවය පාලනය කිරීම (උදාහරණයක් ලෙස, අර්ධ අතිරික්ත විශ්ලේෂණය භාවිතා කිරීම) සෛල වර්ග අතර ස්ථාවර වෙනස්කම් පෙන්නුම් කරන අතර, සෛල වර්ග සහ/හෝ ක්ෂුද්‍ර පරිසරය පරිවෘත්තීය පැතිකඩ අනුව පැහැදිලිව එකතු කර ඇත (රූපය 2F). තනි පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය මෙම බලපෑම් අවධාරණය කළ අතර සෛල වර්ග සහ ක්ෂුද්‍ර පරිසරය අතර සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය විය. නිරීක්ෂණය කරන ලද වඩාත්ම ආන්තික වෙනස MNA බව සඳහන් කිරීම වටී, එය සාමාන්‍යයෙන් CD45- සෛලවල සහ ගෙඩියට ඇතුළු වන CD4+ සහ CD8+ සෛලවල (රූපය 3A) පොහොසත් වේ. CD4 + සෛල සඳහා, මෙම බලපෑම වඩාත් පැහැදිලි වන අතර, CD8 + සෛලවල MNA ද පරිසරයෙන් දැඩි ලෙස බලපාන බව පෙනේ. කෙසේ වෙතත්, මෙය වැදගත් නොවේ, මන්ද රෝගීන් හය දෙනාගෙන් තිදෙනෙකුට පමණක් පිළිකා CD8+ ලකුණු සඳහා ඇගයීමට ලක් කළ හැකිය. MNA වලට අමතරව, ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වල විවිධ වර්ගයේ සෛලවල, TIL හි දුර්වල ලෙස සංලක්ෂිත අනෙකුත් පරිවෘත්තීය ද වෙනස් ලෙස පොහොසත් වේ (රූප S3 සහ S4). එමනිසා, මෙම දත්ත වැඩිදුර පර්යේෂණ සඳහා පොරොන්දු වූ ප්‍රතිශක්තිකරණ පරිවෘත්තීය කට්ටලයක් හෙළි කරයි.
(A) ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වලින් CD4+, CD8+ සහ CD45- සෛලවල MNA හි සාමාන්‍යකරණය කළ අන්තර්ගතය. කොටු සටහන මධ්‍ය (රේඛාව), අන්තර් කාර්තු පරාසය (රාමු hinge) සහ දත්ත පරාසය, අන්තර් කාර්තු පරාසය (රාමු hinge) මෙන් 1.5 ගුණයක් දක්වා පෙන්වයි. රෝගියාගේ ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි, P අගය තීරණය කිරීම සඳහා රෝගියාගේ ලිම්මා අගය භාවිතා කරන්න (*P<0.05 සහ **P<0.01). (B) MNA පරිවෘත්තීයතාවයේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන (60). පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, නිකොටිනාමයිඩ් මොනොනියුක්ලියෝටයිඩ. එන්සයිම (කොළ): NNMT, නිකොටිනාමයිඩ් N-මෙතිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස්; SIRT, සර්ටුයින්; NAMPT, නිකොටිනාමයිඩ් පොස්පරයිබොසයිල් ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස්; AOX1, ඇල්ඩිහයිඩ් ඔක්සිඩේස් 1; NRK, නිකොටිනාමයිඩ් රයිබොසයිඩ් කයිනේස්; NMNAT, නිකොටිනාමයිඩ් මොනෝ නියුක්ලියෝටයිඩ් ඇඩිනිලේට් ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස්; Pnp1, පියුරීන් නියුක්ලියෝසයිඩ් පොස්පරයිලේස්. (C) ඇස්කයිට් (අළු) සහ පිළිකා (රතු; n = රෝගීන් 3) හි scRNA-seq හි t-SNE. (D) scRNA-seq භාවිතයෙන් හඳුනාගත් විවිධ සෛල ජනගහනයේ NNMT ප්‍රකාශනය. (E) SK-OV-3, මානව කළල වකුගඩු (HEK) 293T, T සෛල සහ MNA-ප්‍රතිකාර කළ T සෛලවල NNMT සහ AOX1 ප්‍රකාශනය. නැමුණු ප්‍රකාශනය SK-OV-3 ට සාපේක්ෂව පෙන්වා ඇත. SEM සමඟ ප්‍රකාශන රටාව පෙන්වා ඇත (n = නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් 6). 35 ට වැඩි Ct අගයන් හඳුනාගත නොහැකි (UD) ලෙස සැලකේ. (F) SK-OV-3, HEK293T, T සෛල සහ 8mM MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද T සෛලවල SLC22A1 සහ SLC22A2 ප්‍රකාශනය. නැමුණු ප්‍රකාශනය SK-OV-3 ට සාපේක්ෂව පෙන්වා ඇත. SEM සමඟ ප්‍රකාශන රටාව පෙන්වා ඇත (n = නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් 6). 35 ට වැඩි Ct අගයන් හඳුනාගත නොහැකි (UD) ලෙස සැලකේ. (G) MNA සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පැය 72 කට පසු සක්‍රිය සෞඛ්‍ය සම්පන්න පරිත්‍යාගශීලී T සෛලවල සෛල MNA අන්තර්ගතය. SEM සමඟ ප්‍රකාශන රටාව පෙන්වා ඇත (n = නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් 4).
නිකොටිනාමයිඩ් N-මෙතිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස් (NNMT; රූපය 3B) මගින් S-adenosyl-1-methionine (SAM) සිට නිකොටිනාමයිඩ් (NA) වෙත මෙතිල් කාණ්ඩය මාරු කිරීමෙන් MNA නිපදවනු ලැබේ. විවිධ මිනිස් පිළිකා වලදී NNMT අධික ලෙස ප්‍රකාශ වන අතර එය ප්‍රගුණනය, ආක්‍රමණය සහ මෙටාස්ටැසිස් සමඟ සම්බන්ධ වේ (25-27). TME හි T සෛලවල MNA ප්‍රභවය වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා, HGSC රෝගීන් තිදෙනෙකුගේ ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වල සෛල වර්ග හරහා NNMT ප්‍රකාශනය සංලක්ෂිත කිරීමට අපි scRNA-seq භාවිතා කළෙමු (වගුව S5). ආසන්න වශයෙන් සෛල 6,500 ක විශ්ලේෂණයකින් පෙන්නුම් කළේ ඇස්කයිට් සහ පිළිකා පරිසරයන්හි, NNMT ප්‍රකාශනය උපකල්පිත ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් සහ පිළිකා සෛල ජනගහනයට සීමා වී ඇති බවයි (රූපය 3, C සහ D). PTPRC (CD45 +) ප්‍රකාශ කරන ඕනෑම ජනගහනයක පැහැදිලි NNMT ප්‍රකාශනයක් නොමැති බව සඳහන් කිරීම වටී (රූපය 3D සහ රූපය S5A), එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ පරිවෘත්තීය වර්ණාවලියේ අනාවරණය වූ MNA T සෛල තුළට හඳුන්වා දී ඇති බවයි. ඇල්ඩිහයිඩ් ඔක්සිඩේස් 1 (AOX1) හි ප්‍රකාශනය MNA 1-මෙතිල්-2-පිරිඩෝන්-5-කාබොක්සමයිඩ් (2-PYR) හෝ 1-මෙතිල්-4-පිරිඩෝන්-5-කාබොක්සමයිඩ් (4-PYR) බවට පරිවර්තනය කරයි; රූපය 3B) COL1A1 (රූපය S5A) ප්‍රකාශ කරන ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් ජනගහනයට ද සීමා වේ, එය එක්ව පෙන්නුම් කරන්නේ T සෛලවලට සාම්ප්‍රදායික MNA පරිවෘත්තීය හැකියාව නොමැති බවයි. මෙම MNA-ආශ්‍රිත ජානවල ප්‍රකාශන රටාව HGSC රෝගීන්ගෙන් ඇස්කයිට් වලින් ලබාගත් දෙවන ස්වාධීන සෛල දත්ත කට්ටලයක් භාවිතයෙන් සත්‍යාපනය කරන ලදී (රූපය S5B; n = 6) (16). ඊට අමතරව, MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලී T සෛලවල ප්‍රමාණාත්මක පොලිමරේස් දාම ප්‍රතික්‍රියා (qPCR) විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ පාලන SK-OV-3 ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සෛල සමඟ සසඳන විට, NNMT හෝ AOX1 පාහේ ප්‍රකාශ නොවූ බවයි (රූපය 3E). මෙම අනපේක්ෂිත ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ MNA ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් හෝ පිළිකා වලින් TME හි යාබද T සෛල වලට ස්‍රාවය විය හැකි බවයි.
අපේක්ෂකයින්ට ද්‍රාව්‍ය වාහක 22 (SLC22) පවුල (SLC22A1, SLC22A2 සහ SLC22A3) විසින් කේතනය කරන ලද කාබනික කැටායන ප්‍රවාහක 1 සිට 3 දක්වා (OCT1, OCT2 සහ OCT3) පවුල ඇතුළත් වුවද, MNA හි විභව ප්‍රවාහක තවමත් නිර්වචනය කර නොමැත (28). නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලී T සෛල වලින් mRNA හි QPCR SLC22A1 හි අඩු ප්‍රකාශන මට්ටම් පෙන්නුම් කළ නමුත් SLC22A2 හි හඳුනාගත නොහැකි මට්ටම් පෙන්නුම් කළ අතර, එය සාහිත්‍යයේ කලින් වාර්තා කර ඇති බව තහවුරු කළේය (රූපය 3F) (29). ඊට වෙනස්ව, SK-OV-3 ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සෛල රේඛාව ප්‍රවාහක දෙකෙහිම ඉහළ මට්ටම් ප්‍රකාශ කළේය (රූපය 3F).
විදේශීය MNA අවශෝෂණය කිරීමේ හැකියාව ඇති T සෛල පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, සෞඛ්‍ය සම්පන්න පරිත්‍යාගශීලී T සෛල පැය 72 ක් MNA හි විවිධ සාන්ද්‍රණයන් ඉදිරියේ වගා කරන ලදී. බාහිර MNA නොමැති විට, MNA හි සෛලීය අන්තර්ගතය අනාවරණය කර ගත නොහැක (රූපය 3G). කෙසේ වෙතත්, බාහිර MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද සක්‍රිය T සෛල සෛලවල MNA අන්තර්ගතයේ මාත්‍රාව මත යැපෙන වැඩිවීමක් පෙන්නුම් කළේය, 6 mM MNA දක්වා (රූපය 3G). මෙම ප්‍රතිඵලයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ ප්‍රවාහන ප්‍රකාශනයේ අඩු මට්ටම සහ අන්තර් සෛලීය MNA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට වගකිව යුතු ප්‍රධාන එන්සයිමයේ ඌනතාවය තිබියදීත්, TIL තවමත් MNA ලබා ගත හැකි බවයි.
රෝගීන්ගේ T සෛලවල පරිවෘත්තීය වර්ණාවලිය සහ in vitro MNA අවශෝෂණ අත්හදා බැලීම් මගින් පිළිකා ආශ්‍රිත ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් (CAF) MNA ස්‍රාවය කිරීමේ හැකියාව වැඩි කරන අතර පිළිකා සෛල TIL හි ෆීනෝටයිප් සහ ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කළ හැකිය. T සෛල මත MNA හි බලපෑම තීරණය කිරීම සඳහා, MNA පවතින විට හෝ නොමැති විට නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලී T සෛල අභ්‍යන්තරව සක්‍රිය කරන ලද අතර, ඒවායේ ප්‍රගුණනය සහ සයිටොකයින් නිෂ්පාදනය ඇගයීමට ලක් කරන ලදී. ඉහළම මාත්‍රාවෙන් MNA එකතු කිරීමෙන් දින 7 කට පසු, ජනගහන දෙගුණ කිරීමේ සංඛ්‍යාව මධ්‍යස්ථව අඩු කරන ලද අතර, සියලු මාත්‍රාවලදී ශක්තිය පවත්වා ගන්නා ලදී (රූපය 4A). ඊට අමතරව, බාහිර MNA ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පිළිකා නෙරෝසිස් සාධකය-α ප්‍රකාශ කරන CD4 + සහ CD8 + T සෛලවල අනුපාතය වැඩි විය (TNFα; රූපය 4B). ඊට වෙනස්ව, CD4 + T සෛලවල IFN-γ හි අන්තර් සෛලීය නිෂ්පාදනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වූ නමුත් CD8 + T සෛලවල නොවේ, සහ ඉන්ටර්ලියුකින් 2 හි සැලකිය යුතු වෙනසක් සිදු නොවීය (IL-2; රූපය 4, C සහ D). එමනිසා, මෙම MNA-ප්‍රතිකාර කළ T සෛල සංස්කෘතීන්ගෙන් ලබාගත් අධිප්‍රේරකවල එන්සයිම-සම්බන්ධිත ප්‍රතිශක්තිකරණ විශ්ලේෂණය (ELISA) TNFα හි සැලකිය යුතු වැඩිවීමක්, IFN-γ හි අඩුවීමක් සහ IL-2 හි කිසිදු වෙනසක් පෙන්නුම් කළේ නැත (රූපය 4, E සිට G දක්වා). . IFN-γ හි අඩුවීම පෙන්නුම් කරන්නේ T සෛලවල පිළිකා නාශක ක්‍රියාකාරිත්වය වැළැක්වීමේදී MNA කාර්යභාරයක් ඉටු කළ හැකි බවයි. T සෛල-මැදිහත් වූ සයිටොටොක්සිසිටි මත MNA හි බලපෑම අනුකරණය කිරීම සඳහා, ෆෝලේට් ප්‍රතිග්‍රාහක α සහ හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) -CAR-T) සෛල මගින් නියාමනය කරනු ලබන ෆෝලේට් ප්‍රතිග්‍රාහක α සහ CAR-T (GFP) ඉලක්ක කරගත් කයිමරික් ප්‍රතිදේහජනක ප්‍රතිග්‍රාහක T (FRα-CAR-T) සෛල නිපදවනු ලබන්නේ නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලී පර්යන්ත රුධිර ඒක න්‍යෂ්ටික සෛල (PBMC) මගිනි. CAR-T සෛල MNA ඉදිරියේ පැය 24 ක් වගා කරන ලද අතර, පසුව 10:1 ක ඵලදායිතාවයකින් ඉලක්කගත අනුපාතයකින් ෆෝලේට් ප්‍රතිග්‍රාහක α ප්‍රකාශ කරන මිනිස් SK-OV-3 ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සෛල සමඟ සම-සංස්කෘති කරන ලදී. MNA ප්‍රතිකාරය FRα-CAR-T සෛලවල ඝාතක ක්‍රියාකාරිත්වය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කිරීමට හේතු වූ අතර, එය ඇඩිනොසීන් සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද FRα-CAR-T සෛල වලට සමාන විය (රූපය 4H).
(A) 7 වන දින සංස්කෘතියෙන් සෘජුවම මුළු ශක්‍ය සෛල ගණන සහ ජනගහන දෙගුණ කිරීම (PD). තීරු ප්‍රස්ථාරය නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් හය දෙනෙකුගේ මධ්‍යන්‍ය + SEM නියෝජනය කරයි. අවම වශයෙන් n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක දත්ත නියෝජනය කරයි. (B සිට D දක්වා) CD3/CD28 සහ IL-2 දින 7 ක් සඳහා අදාළ MNA සාන්ද්‍රණයන්හි T සෛල සක්‍රිය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. විශ්ලේෂණයට පෙර, GolgiStop සමඟ PMA/ionomycin සමඟ සෛල පැය 4 ක් උත්තේජනය කරන ලදී. T සෛලවල TNFα (B) ප්‍රකාශනය. ජීව සෛලවල TNFα ප්‍රකාශනයේ උදාහරණ රූපය (වමේ) සහ වගු දත්ත (දකුණේ). T සෛලවල IFN-γ (C) සහ IL-2 (D) ප්‍රකාශනය. සයිටොකයින් ප්‍රකාශනය ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මගින් මනිනු ලැබීය. තීරු ප්‍රස්ථාරය මධ්‍යන්‍යය (n = නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් 6) + SEM නියෝජනය කරයි. P අගය තීරණය කිරීම සඳහා විචලනය සහ පුනරාවර්තන මිනුම් (*P<0.05 සහ **P<0.01) පිළිබඳ ඒකපාර්ශ්වික විශ්ලේෂණයක් භාවිතා කරන්න. අවම වශයෙන් n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක දත්ත නියෝජනය කරයි. (E සිට G දක්වා) CD3/CD28 සහ IL-2 දින 7ක් සඳහා ඒවායේ අදාළ MNA සාන්ද්‍රණයන්හිදී T සෛල සක්‍රිය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. PMA/ionomycin උත්තේජනයට පැය 4කට පෙර සහ පසු මාධ්‍යය එකතු කරන ලදී. TNFα (E), IFN-γ (F) සහ IL-2 (G) සාන්ද්‍රණයන් ELISA මගින් මනිනු ලැබීය. තීරු ප්‍රස්ථාරය මධ්‍යන්‍යය (n = නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් 5) + SEM නියෝජනය කරයි. විචලනය පිළිබඳ ඒකපාර්ශ්වික විශ්ලේෂණය සහ නැවත නැවත මිනුම් (*P<0.05) භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලද P අගය. තිත් රේඛාව හඳුනාගැනීමේ හඳුනාගැනීමේ සීමාව දක්වයි. (H) සෛල ලයිසිස් විශ්ලේෂණය. FRα-CAR-T හෝ GFP-CAR-T සෛල ඇඩෙනොසීන් (250μM) හෝ MNA (10 mM) සමඟ පැය 24ක් සඳහා සකස් කරන ලදී, නැතහොත් ප්‍රතිකාර නොකළ (Ctrl). SK-OV-3 සෛලවල ප්‍රතිශත ඝාතනය මනිනු ලැබීය. P අගය වෙල්ච් t පරීක්ෂණය (*P<0.5 සහ **P<0.01) මගින් තීරණය කරන ලදී.
MNA-යැපෙන TNFα ප්‍රකාශන නියාමනය පිළිබඳ යාන්ත්‍රික අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා, MNA-ප්‍රතිකාර කළ T සෛලවල TNFα mRNA හි වෙනස්කම් ඇගයීමට ලක් කරන ලදී (රූපය 5A). MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලී T සෛල TNFα පිටපත් කිරීමේ මට්ටම්වල දෙගුණයක වැඩිවීමක් පෙන්නුම් කළ අතර, MNA TNFα පිටපත් කිරීමේ නියාමනය මත රඳා පවතින බව පෙන්නුම් කරයි. මෙම විය හැකි නියාමන යාන්ත්‍රණය විමර්ශනය කිරීම සඳහා, TNFα නියාමනය කරන දන්නා පිටපත් කිරීමේ සාධක දෙකක්, එනම් සක්‍රිය T සෛල න්‍යෂ්ටික සාධකය (NFAT) සහ නිශ්චිත ප්‍රෝටීන් 1 (Sp1), සමීප TNFα ප්‍රවර්ධකයට MNA බන්ධනයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් ඇගයීමට ලක් කරන ලදී (30). TNFα ප්‍රවර්ධකයේ හඳුනාගත් NFAT බන්ධන අඩවි 6 ක් සහ Sp1 බන්ධන අඩවි 2 ක් අඩංගු වන අතර, එක් ස්ථානයක අතිච්ඡාදනය වේ [-5'cap සිට පාදක යුගල (bp)] (30). ක්‍රෝමැටින් ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණය (ChIP) පෙන්නුම් කළේ MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන විට, TNFα ප්‍රවර්ධකයට Sp1 බන්ධනය තුන් ගුණයකින් වැඩි වූ බවයි. NFAT ඇතුළත් කිරීම ද වැඩි වී වැදගත්කමට ළඟා විය (රූපය 5B). මෙම දත්තවලින් පෙනී යන්නේ MNA මගින් Sp1 පිටපත් කිරීම හරහා TNFα ප්‍රකාශනය නියාමනය කරන බවත්, යම් දුරකට NFAT ප්‍රකාශනය නියාමනය කරන බවත්ය.
(A) MNA නොමැතිව වගා කරන ලද T සෛල සමඟ සසඳන විට, MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද T සෛලවල TNFα ප්‍රකාශනයේ නැමීමේ වෙනස. SEM සමඟ ප්‍රකාශන රටාව පෙන්වා ඇත (n = නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලීන් 5). අවම වශයෙන් n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක දත්ත නියෝජනය කරයි. (B) NFAT සහ Sp1 පසු 8 mM MNA සමඟ හෝ නැතිව ප්‍රතිකාර කරන ලද T සෛලවල TNFα ප්‍රවර්ධකය පැය 4 ක් සඳහා (Ctrl) සහ PMA/ionomycin උත්තේජනය සමඟ ඒකාබද්ධ කරන ලදී. ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණය සඳහා Immunoglobulin G (IgG) සහ H3 පිළිවෙලින් සෘණ සහ ධනාත්මක පාලනයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. ChIP හි ප්‍රමාණනය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ MNA-ප්‍රතිකාර කරන ලද සෛලවල TNFα ප්‍රවර්ධකයට Sp1 සහ NFAT බන්ධනය පාලනයට සාපේක්ෂව කිහිප ගුණයකින් වැඩි වී ඇති බවයි. අවම වශයෙන් n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක දත්ත නියෝජනය කරයි. බහු t-පරීක්ෂණ මගින් තීරණය කරන ලද P අගය (*** P <0.01). (C) HGSC හි ඇස්කයිට් හා සසඳන විට, T සෛල (සයිටොටොක්සික් නොවන) පිළිකාවේ TNF හි වැඩි ප්‍රකාශනයක් පෙන්නුම් කළේය. වර්ණ විවිධ රෝගීන් නියෝජනය කරයි. ප්‍රදර්ශනය කරන ලද සෛල අහඹු ලෙස 300 දක්වා සාම්පල ලබාගෙන ඇති අතර අධික ලෙස ඇඳීම සීමා කිරීම සඳහා කම්පනයට පත් කර ඇත (** Padj = 0.0076). (D) ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සඳහා යෝජිත MNA ආකෘතිය. TME හි පිළිකා සෛල සහ ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් වල MNA නිපදවන අතර එය T සෛල මගින් ලබා ගනී. MNA TNFα ප්‍රවර්ධකයට Sp1 බන්ධනය වැඩි කරයි, එමඟින් TNFα පිටපත් කිරීම සහ TNFα සයිටොකයින් නිෂ්පාදනය වැඩි වේ. MNA IFN-γ හි අඩුවීමක් ද ඇති කරයි. T සෛල ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීම මරා දැමීමේ හැකියාව අඩු කිරීමට සහ පිළිකා වර්ධනය වේගවත් කිරීමට හේතු වේ.
වාර්තාවලට අනුව, TNFα හට ඉදිරිපස සහ පසුපස මත යැපෙන ප්‍රති-පිළිකා සහ ප්‍රති-පිළිකා බලපෑම් ඇත, නමුත් ඩිම්බකෝෂ පිළිකා වර්ධනය සහ පරිවෘත්තීය ප්‍රවර්ධනය කිරීමේදී එය ප්‍රසිද්ධ කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි (31-33). වාර්තාවලට අනුව, ඩිම්බකෝෂ පිළිකා ඇති රෝගීන්ගේ ඇස්කයිට් සහ පිළිකා පටක වල TNFα සාන්ද්‍රණය නිරෝගී පටක වලට වඩා වැඩි ය (34-36). යාන්ත්‍රණය අනුව, TNFα හට සුදු රුධිරාණු සක්‍රිය කිරීම, ක්‍රියාකාරිත්වය සහ ප්‍රගුණනය නියාමනය කළ හැකි අතර පිළිකා සෛලවල ප්‍රවේණිකත්වය වෙනස් කළ හැකිය (37, 38). මෙම සොයාගැනීම් වලට අනුකූලව, අවකල ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ ඇස්කයිට් හා සසඳන විට පිළිකා පටක වල T සෛලවල TNF සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ගොස් ඇති බවයි (රූපය 5C). TNF ප්‍රකාශනයේ වැඩිවීම පැහැදිලිව දක්නට ලැබුණේ සයිටොටොක්සික් නොවන ෆීනෝටයිප් සහිත T සෛල ජනගහනය තුළ පමණි (රූපය S5A). සාරාංශයක් ලෙස, මෙම දත්ත MNA හි HGSC හි ද්විත්ව ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දන සහ පිළිකා ප්‍රවර්ධන බලපෑම් ඇති බවට ඇති මතයට සහාය දක්වයි.
ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මත පදනම් වූ ප්‍රතිදීප්ත ලේබල් කිරීම TIL පරිවෘත්තීය අධ්‍යයනය කිරීමේ ප්‍රධාන ක්‍රමය බවට පත්ව ඇත. මෙම අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ද්විතියික ලිම්ෆොයිඩ් අවයව වලින් ලැබෙන පර්යන්ත රුධිර ලිම්ෆොසයිට් හෝ T සෛල හා සසඳන විට, මියුරීන් සහ මිනිස් TIL ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය කර ගැනීමේ වැඩි ප්‍රවණතාවක් ඇති බවයි (4, 39) සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය ක්‍රමයෙන් නැතිවීම (19, 40). මෙම අධ්‍යයනයේ දී අපි සමාන ප්‍රතිඵල නිරීක්ෂණය කර ඇතත්, ප්‍රධාන වර්ධනය වන්නේ පිළිකා සෛල සහ TIL වල පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය එකම වෙන් කරන ලද පිළිකා පටක වලින් සංසන්දනය කිරීමයි. මෙම පෙර වාර්තා කිහිපයකට අනුකූලව, ඇස්කයිට් සහ පිළිකා වලින් ලැබෙන පිළිකා (CD45-EpCAM +) සෛල CD8 + සහ CD4 + T සෛල වලට වඩා ඉහළ ග්ලූකෝස් අවශෝෂණයක් ඇති අතර, පිළිකා සෛලවල ඉහළ ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය T සෛල සමඟ සැසඳිය හැකි බවට සහාය වේ. T සෛල තරඟකාරිත්වය පිළිබඳ සංකල්පය. TME. කෙසේ වෙතත්, පිළිකා සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය CD8 + T සෛල වලට වඩා ඉහළ ය, නමුත් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය CD4 + T සෛල වලට සමාන ය. මෙම ප්‍රතිඵල පිළිකා සෛල සඳහා ඔක්සිකාරක පරිවෘත්තීය වැදගත් බවට මතුවන තේමාව ශක්තිමත් කරයි (41, 42). CD8 + T සෛල CD4 + T සෛල වලට වඩා ඔක්සිකාරක අක්‍රියතාවයට ගොදුරු විය හැකි බව හෝ CD4 + T සෛල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය පවත්වා ගැනීම සඳහා ග්ලූකෝස් හැර වෙනත් කාබන් ප්‍රභවයන් භාවිතා කළ හැකි බව ද ඔවුන් යෝජනා කරයි (43, 44). CD4 + T ඵලදායික, T ඵලදායික මතකය සහ ඇස්කයිට් වල T මධ්‍යම මතක සෛල අතර ග්ලූකෝස් අවශෝෂණයේ හෝ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයේ වෙනසක් අප නිරීක්ෂණය නොකළ බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය. ඒ හා සමානව, පිළිකා වල CD8 + T සෛලවල අවකලනය වීමේ තත්ත්වය ග්ලූකෝස් අවශෝෂණයේ වෙනස්කම් සමඟ කිසිදු සම්බන්ධයක් නොමැති අතර, එය විට්‍රෝ තුළ වගා කරන ලද T සෛල සහ විවෝ තුළ මානව TIL අතර සැලකිය යුතු වෙනස ඉස්මතු කරයි (22). මෙම නිරීක්ෂණ අපක්ෂපාතී ස්වයංක්‍රීය සෛල ජනගහන වෙන් කිරීම භාවිතයෙන් ද තහවුරු කරන ලද අතර, එමඟින් පිළිකා සෛල වලට වඩා ඉහළ ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය සහිත CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + සෛල බහුලව පවතින නමුත් පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරී සෛල ජනගහනයක් ඇති බව තවදුරටත් හෙළි විය. මෙම ජනගහනය scRNA-seq විශ්ලේෂණයේදී හඳුනාගත් මයිලොයිඩ් මර්දන සෛල හෝ ප්ලාස්මාසයිටොයිඩ් ඩෙන්ඩ්‍රිටික් සෛලවල උපකල්පිත උප ජනගහනය නියෝජනය කළ හැකිය. මේ දෙකම මිනිස් ඩිම්බකෝෂ පිළිකාවල [45] වාර්තා වී ඇතත්, ඒවාට තවමත් අවශ්‍ය වේ. මෙම මයිලෝයිඩ් උප ජනගහනය විස්තර කිරීම සඳහා වැඩිදුර කටයුතු අවශ්‍ය වේ.
ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මත පදනම් වූ ක්‍රම මගින් සෛල වර්ග අතර ග්ලූකෝස් සහ ඔක්සිකාරක පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියේ සාමාන්‍ය වෙනස්කම් පැහැදිලි කළ හැකි වුවද, TME හි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය සඳහා ග්ලූකෝස් හෝ වෙනත් කාබන් ප්‍රභවයන් මගින් නිපදවන නිශ්චිත පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය තවමත් තීරණය කර නොමැත. දී ඇති TIL උප කුලකයකට පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය පැවතීම හෝ නොපැවතීම පැවරීම සඳහා ඉවත් කරන ලද පටක වලින් සෛල ජනගහනය පිරිසිදු කිරීම අවශ්‍ය වේ. එබැවින්, ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය සමඟ ඒකාබද්ධව අපගේ සෛල පොහොසත් කිරීමේ ක්‍රමය මඟින් රෝගියාගේ සාම්පල ගැලපීමේදී T සෛල සහ පිළිකා සෛල ජනගහනය තුළ වෙනස් ලෙස පොහොසත් කර ඇති පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා දිය හැකිය. මෙම ක්‍රමයට ප්‍රතිදීප්ත-සක්‍රිය සෛල වර්ග කිරීමට වඩා වාසි තිබුණද, ආවේණික ස්ථායිතාව සහ/හෝ වේගවත් පිරිවැටුම් අනුපාතය හේතුවෙන් ඇතැම් පරිවෘත්තීය පුස්තකාලවලට බලපෑම් ඇති විය හැකිය (22). කෙසේ වෙතත්, අපගේ ක්‍රමයට හඳුනාගත් ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දන පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය දෙකක්, ඇඩෙනොසීන් සහ කයිනුරීන් හඳුනා ගැනීමට හැකි විය, මන්ද ඒවා සාම්පල වර්ග අතර බෙහෙවින් වෙනස් වේ.
පිළිකා සහ TIL උප වර්ග පිළිබඳ අපගේ පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය ඩිම්බකෝෂ TME හි පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවල කාර්යභාරය පිළිබඳ වැඩි අවබෝධයක් ලබා දෙයි. පළමුව, ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි භාවිතා කරමින්, පිළිකා සහ CD4 + T සෛල අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයේ වෙනසක් නොමැති බව අපි තීරණය කළෙමු. කෙසේ වෙතත්, LC-MS/MS විශ්ලේෂණයෙන් මෙම ජනගහනය අතර පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය වූ අතර, TIL පරිවෘත්තීය සහ එහි සමස්ත පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ නිගමනවලට ප්‍රවේශමෙන් අර්ථ නිරූපණය අවශ්‍ය බව පෙන්නුම් කරයි. දෙවනුව, MNA යනු පිළිකා නොව ඇස්කයිට් වල CD45-සෛල සහ T සෛල අතර විශාලතම වෙනස ඇති පරිවෘත්තීය වේ. එබැවින්, කොටස්කරණය සහ පිළිකා පිහිටීම TIL පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට වෙනස් බලපෑම් ඇති කළ හැකි අතර, එය දී ඇති ක්ෂුද්‍ර පරිසරයක ඇති විය හැකි විෂමතාවය ඉස්මතු කරයි. තෙවනුව, MNA නිපදවන එන්සයිම NNMT හි ප්‍රකාශනය ප්‍රධාන වශයෙන් CAF වලට සීමා වේ, එය පිළිකා සෛල තරමක් අඩු ප්‍රමාණයකට වේ, නමුත් හඳුනාගත හැකි MNA මට්ටම් පිළිකාවෙන් ලබාගත් T සෛලවල නිරීක්ෂණය කෙරේ. ඩිම්බකෝෂ CAF හි NNMT හි අධික ලෙස ප්‍රකාශනයට දන්නා පිළිකා ප්‍රවර්ධන බලපෑමක් ඇත, අර්ධ වශයෙන් CAF පරිවෘත්තීය, පිළිකා ආක්‍රමණය සහ මෙටාස්ටැසිස් ප්‍රවර්ධනය කිරීම හේතුවෙන් (27). සමස්ත TIL මට්ටම මධ්‍යස්ථ වුවද, CAF හි NNMT ප්‍රකාශනය පිළිකා ජෙනෝම් ඇට්ලස් (TCGA) මෙසෙන්චයිමල් උප වර්ගයට සමීපව සම්බන්ධ වන අතර එය දුර්වල පුරෝකථනය සමඟ සම්බන්ධ වේ (27, 46, 47). අවසාන වශයෙන්, MNA හායනය සඳහා වගකිව යුතු AOX1 එන්සයිමයේ ප්‍රකාශනය ද CAF ජනගහනයට සීමා වේ, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ T සෛලවලට MNA පරිවෘත්තීය කිරීමේ හැකියාව නොමැති බවයි. මෙම සොයා ගැනීම සත්‍යාපනය කිරීම සඳහා තවදුරටත් කටයුතු අවශ්‍ය වුවද, T සෛලවල ඉහළ මට්ටමේ MNA ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දන CAF ක්ෂුද්‍ර පරිසරයක් පවතින බව පෙන්නුම් කළ හැකිය යන අදහසට මෙම ප්‍රතිඵල සහාය දක්වයි.
MNA ප්‍රවාහකයන්ගේ අඩු ප්‍රකාශන මට්ටම සහ MNA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ප්‍රධාන ප්‍රෝටීන වල හඳුනාගත නොහැකි මට්ටම් සැලකිල්ලට ගෙන, T සෛල තුළ MNA පැවතීම අනපේක්ෂිත ය. NNMT හෝ AOX1 යන දෙකම scRNA-seq විශ්ලේෂණය සහ ස්වාධීන කණ්ඩායම් දෙකක ඉලක්කගත qPCR මගින් අනාවරණය කර ගත නොහැකි විය. මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ MNA T සෛල මගින් සංස්ලේෂණය කර නොමැති නමුත් අවට TME වලින් අවශෝෂණය කර ඇති බවයි. අභ්‍යන්තර අත්හදා බැලීම්වලින් පෙනී යන්නේ T සෛල බාහිර MNA රැස් කිරීමට නැඹුරු වන බවයි.
අපගේ අභ්‍යන්තර අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ බාහිර MNA මගින් T සෛල තුළ TNFα ප්‍රකාශනය ඇති කරන අතර TNFα ප්‍රවර්ධකයට Sp1 බන්ධනය වැඩි දියුණු කරන බවයි. TNFα හට පිළිකා නාශක සහ පිළිකා නාශක ක්‍රියාකාරකම් දෙකම තිබුණද, ඩිම්බකෝෂ පිළිකා වලදී, TNFα හට ඩිම්බකෝෂ පිළිකා වර්ධනය ප්‍රවර්ධනය කළ හැකිය (31-33). ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සෛල සංස්කෘතියේ TNFα උදාසීන කිරීම හෝ මූසික ආකෘතිවල TNFα සංඥාව ඉවත් කිරීම TNFα-මැදිහත් වූ ගිනි අවුලුවන සයිටොකයින් නිෂ්පාදනය වැඩි දියුණු කළ හැකි අතර පිළිකා වර්ධනය වළක්වයි (32, 35). එමනිසා, මෙම අවස්ථාවේ දී, TME-ව්‍යුත්පන්න MNA හට ස්වයංක්‍රීය ලූපය හරහා TNFα-යැපෙන යාන්ත්‍රණයක් හරහා ප්‍රෝ-ගිනි අවුලුවන පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයක් ලෙස ක්‍රියා කළ හැකි අතර එමඟින් ඩිම්බකෝෂ පිළිකා ඇතිවීම සහ පැතිරීම ප්‍රවර්ධනය කළ හැකිය (31). මෙම හැකියාව මත පදනම්ව, ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සඳහා විභව චිකිත්සක කාරකයක් ලෙස TNFα අවහිර කිරීම අධ්‍යයනය කෙරේ (37, 48, 49). ඊට අමතරව, MNA මගින් ඩිම්බකෝෂ පිළිකා සෛල වලට CAR-T සෛලවල සයිටොටොක්සිසිටි බව අඩාල කරන අතර, MNA-මැදිහත් වූ ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දනය සඳහා තවදුරටත් සාක්ෂි සපයයි. සාමූහිකව, මෙම ප්‍රතිඵල මගින් පිළිකා සහ CAF සෛල MNA බාහිර සෛලීය TME බවට ස්‍රාවය කරන ආකෘතියක් යෝජනා කරයි. (i) TNF-ප්‍රේරිත ඩිම්බකෝෂ පිළිකා වර්ධන උත්තේජනය සහ (ii) MNA-ප්‍රේරිත T සෛල සයිටොටොක්සික් ක්‍රියාකාරකම් නිෂේධනය හරහා, මෙය ද්විත්ව පිළිකා බලපෑමක් ඇති කළ හැකිය (රූපය 5D).
අවසාන වශයෙන්, වේගවත් සෛල සුපෝෂණය, තනි සෛල අනුක්‍රමණය සහ පරිවෘත්තීය පැතිකඩ සංයෝජනයක් යෙදීමෙන්, මෙම අධ්‍යයනයෙන් HGSC රෝගීන්ගේ පිළිකා සහ ඇස්කයිට් සෛල අතර ඇති දැවැන්ත ප්‍රතිශක්තිකරණ පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් අනාවරණය විය. මෙම පුළුල් විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ ටී සෛල අතර ග්ලූකෝස් අවශෝෂණය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයේ වෙනස්කම් ඇති බවත්, MNA සෛල නොවන ස්වයංක්‍රීය ප්‍රතිශක්තිකරණ නියාමන පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇති බවත්ය. මෙම දත්ත මිනිස් පිළිකා වල ටී සෛල පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට TME බලපාන ආකාරය කෙරෙහි බලපෑමක් ඇති කරයි. ටී සෛල සහ පිළිකා සෛල අතර පෝෂ්‍ය පදාර්ථ සඳහා සෘජු තරඟය වාර්තා වී ඇතත්, පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය පිළිකා ප්‍රගතිය ප්‍රවර්ධනය කිරීමට සහ සමහර විට ආවේණික ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර මර්දනය කිරීමට වක්‍ර නියාමකයින් ලෙසද ක්‍රියා කළ හැකිය. මෙම නියාමන පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවල ක්‍රියාකාරී භූමිකාව පිළිබඳ වැඩිදුර විස්තරය පිළිකා විරෝධී ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා විකල්ප උපාය මාර්ග විවෘත කළ හැකිය.
කැනේඩියානු පටක නිධි ජාලය විසින් සහතික කරන ලද BC පිළිකා පිළිකා පටක ගබඩාව හරහා රෝගියාගේ නිදර්ශක සහ සායනික දත්ත ලබා ගන්නා ලදී. BC පිළිකා පර්යේෂණ ආචාර ධර්ම කමිටුව සහ බ්‍රිතාන්‍ය කොලොම්බියා විශ්ව විද්‍යාලය (H07-00463) විසින් අනුමත කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයට අනුව, සියලුම රෝගීන්ගේ නිදර්ශක සහ සායනික දත්ත දැනුවත් ලිඛිත කැමැත්ත ලබාගෙන හෝ විධිමත් ලෙස ඔවුන්ගේ කැමැත්ත අත්හැර ඇත. සාම්පල සහතික කළ ජෛව බැංකුවේ (BRC-00290) ගබඩා කර ඇත. සවිස්තරාත්මක රෝගී ලක්ෂණ වගු S1 සහ S5 හි දක්වා ඇත. ක්‍රියෝප්‍රෙසර්වේෂන් සඳහා, රෝගියාගේ පිළිකා සාම්පලය යාන්ත්‍රිකව දිරාපත් කිරීමට සහ පසුව තනි සෛල අත්හිටුවීමක් ලබා ගැනීම සඳහා මයික්‍රෝන 100 පෙරහනක් හරහා තල්ලු කිරීමට හිස්කබලක් භාවිතා කරයි. රෝගියාගේ ඇස්කයිට් 4°C දී මිනිත්තු 10 ක් සඳහා 1500 rpm හි කේන්ද්‍රාපසාරී කර සෛල පෙති කර සුපිරි ද්‍රව්‍ය ඉවත් කරන ලදී. පිළිකා සහ ඇස්කයිට් වලින් ලබාගත් සෛල 50% තාප-අක්‍රිය මානව AB සෙරුමය (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්), 40% RPMI-1640 (තර්මෝ ෆිෂර් විද්‍යාත්මක) සහ 10% ඩයිමෙතිල් සල්ෆොක්සයිඩ් වල ක්‍රයෝප්‍රෙසර් කරන ලදී. මෙම සංරක්ෂිත තනි සෛල අත්හිටුවීම් දියකර පහත විස්තර කර ඇති පරිවෘත්තීය හා පරිවෘත්තීය නිර්ණය සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
සම්පූර්ණ මාධ්‍යය 0.22 μm පෙරහන් කළ 50:50 පරිපූරක RPMI 1640: AimV වලින් සමන්විත වේ. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) 10% තාප-අක්‍රිය මානව AB සෙරුමය (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific, 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) ද්‍රාවණය (Thermo Fisher Scientific) සහ 50 μMB-mercaptoethanol සමඟ පරිපූරක කර ඇත. AimV (Invitrogen) 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) සහ 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) සමඟ පරිපූරක කර ඇත. ප්‍රවාහ සයිටෝමීටර පැල්ලම් කිරීමේ බෆරය 3% තාප-අක්‍රිය AB මානව සෙරුමය (Sigma) සමඟ පරිපූරක කර ඇති 0.22μm පෙරහන් කළ පොස්පේට් බෆරඩ් සේලයින් (PBS; Invitrogen) වලින් සමන්විත විය. සෛල පොහොසත් කිරීමේ බෆරය 0.22μm පෙරහන් කළ PBS වලින් සමන්විත වන අතර 0.5% තාප-අක්‍රිය මානව AB සෙරුමය (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) සමඟ අතිරේක වේ.
37°C සම්පූර්ණ මාධ්‍යයේදී, සෛල 10 nM MT DR සහ 100 μM 2-NBDG සමඟ මිනිත්තු 30ක් පැල්ලම් කරන ලදී. ඊළඟට, සෛල 4°C දී විනාඩි 15ක් සඳහා ශක්‍යතා ඩයි eF506 සමඟ පැල්ලම් කරන ලදී. FC Block (eBioscience) සහ Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) හි සෛල නැවත සවි කරන්න, ප්‍රවාහ සයිටෝමීටර පැල්ලම් බෆරයේ (නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව) තනුක කරන්න, සහ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 10ක් ඉන්කියුබේට් කරන්න. 4°C දී ප්‍රවාහ සයිටෝමීටර පැල්ලම් බෆරයේ ප්‍රතිදේහ කට්ටලයක් (වගුව S2) සමඟ සෛල පැල්ලම් කරන්න, මිනිත්තු 20ක් සඳහා. විශ්ලේෂණයට පෙර ප්‍රවාහ සයිටෝමීටරි පැල්ලම් බෆරයේ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R වින්‍යාසය) සෛල නැවත සවි කරන්න. සෛල ගණන් දත්ත විශ්ලේෂණය කිරීමට SpectroFlo සහ FlowJo V10 භාවිතා කරන්න, සහ දත්ත නිර්මාණය කිරීමට GraphPad Prism 8 භාවිතා කරන්න. 2-NBDG සහ MT DR වල මධ්‍ය ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය (MFI) ලොග්-සාමාන්‍යකරණය කරන ලද අතර, පසුව ගැලපෙන රෝගීන් සඳහා සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා යුගල කළ t පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරන ලදී. සිදුවීම් 40 ට අඩු සියලුම ජනගහනය විශ්ලේෂණයෙන් ඉවත් කරන්න; සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සහ දත්ත දෘශ්‍යකරණය සිදු කිරීමට පෙර ඕනෑම සෘණ අගයක් සඳහා 1 ක MFI අගයක් ඇතුළත් කරන්න.
ඉහත ක්‍රියාවලි පැනලයේ අතින් ගේට්ටු කිරීමේ උපාය මාර්ගයට අතිරේකව, FlowJo හි මිය ගිය සෛල ඉවත් කිරීමෙන් පසු ජනගහනයට සෛල ස්වයංක්‍රීයව පැවරීම සඳහා අපි හැඩය සීමා කිරීමේ ගස (FAUST) (21) මගින් සම්පූර්ණ විවරණය භාවිතා කළෙමු. වැරදි ලෙස වෙන් කර ඇති බව පෙනෙන (PD1+ PD1-පිළිකා සෛල සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීම) සහ රඳවා ගත් ජනගහනය ඒකාබද්ධ කිරීම සඳහා අපි ප්‍රතිදානය අතින් කළමනාකරණය කරමු. සෑම සාම්පලයකම මුළු ජනගහනය 11 ක් සඳහා සාමාන්‍යයෙන් සෛල 2% කට වඩා අඩංගු වේ.
ලියුකෝසයිට් වෙන් කිරීමේ නිෂ්පාදන වලින් PBMC වෙන් කිරීම සඳහා Ficoll අනුක්‍රමික ඝනත්ව කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය භාවිතා කරන ලදී (STEMCELL Technologies). නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව CD8 + T සෛල CD8 MicroBeads (Miltenyi) භාවිතයෙන් PBMC වලින් හුදකලා කරන ලද අතර TransAct (Miltenyi) භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ මාධ්‍යයෙන් සති 2 ක් පුළුල් කරන ලදී. IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) අඩංගු සම්පූර්ණ මාධ්‍යයෙන් සෛල දින 5 ක් රැඳී සිටීමට ඉඩ දෙන ලද අතර පසුව TransAct සමඟ නැවත උත්තේජනය කරන ලදී. 7 වන දින, නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව, මිනිස් CD45 MicroBeads (Miltenyi) අඛණ්ඩ වට තුනකින් සෛල පොහොසත් කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි විශ්ලේෂණය සඳහා සෛල ඇල්කොහොල් කරන ලද අතර (ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි), සහ LC-MS/MS විශ්ලේෂණය සඳහා සෛල මිලියනයක් තුන් වරක් ඇල්කොහොල් කරන ලදී. පහත විස්තර කර ඇති පරිදි සාම්පල LC-MS/MS මගින් සකසන ලදී. 1,000 ක අයන අංකයක් සහිත අතුරුදහන් වූ පරිවෘත්තීය අගය අපි ඇස්තමේන්තු කළෙමු. සෑම සාම්පලයක්ම මුළු අයන අංකය (TIC) මගින් සාමාන්‍යකරණය කර, ලඝුගණකව පරිවර්තනය කර විශ්ලේෂණයට පෙර MetaboAnalystR හි ස්වයංක්‍රීයව සාමාන්‍යකරණය කරනු ලැබේ.
එක් එක් රෝගියාගේ තනි සෛල අත්හිටුවීම දියකර 40 μm පෙරහනක් හරහා සම්පූර්ණ මාධ්‍යයට පෙරීම සිදු කරන ලදී (ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි). ​​නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලයට අනුව, CD8+, CD4+ සහ CD45- සෛල (අයිස් මත) සඳහා සාම්පල පොහොසත් කිරීම සඳහා MicroBeads (Miltenyi) භාවිතයෙන් චුම්භක පබළු වෙන් කිරීම මගින් අඛණ්ඩව ධනාත්මක තේරීමේ වට තුනක් භාවිතා කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, සෛල සෛල පොහොසත් කිරීමේ බෆරයේ (ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි) නැවත රඳවා තබා ගණන් කරනු ලැබේ. සෛල 4°C දී මිනිත්තු 15ක් සඳහා මිනිස් CD8 පබළු, මිනිස් CD4 පබළු හෝ මානව CD45 පබළු (Miltenyi) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද අතර පසුව සෛල පොහොසත් කිරීමේ බෆරයෙන් සෝදා හරින ලදී. නියැදිය LS තීරුව (Miltenyi) හරහා යවනු ලබන අතර, ධනාත්මක සහ සෘණ භාග එකතු කරනු ලැබේ. කාලසීමාව අඩු කිරීමට සහ සෛල ප්‍රතිසාධන පියවර උපරිම කිරීමට, CD8-භාගය CD4+ පොහොසත් කිරීමේ දෙවන වටය සඳහා භාවිතා කරන අතර, CD4-භාගය පසුව CD45-පොහොසත් කිරීම සඳහා භාවිතා කරයි. වෙන් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය පුරාම ද්‍රාවණය අයිස් මත තබා ගන්න.
පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය සඳහා සාම්පල සකස් කිරීම සඳහා, සෛල අයිස්-සීතල ලුණු ද්‍රාවණයකින් එක් වරක් සෝදා, සෑම සාම්පලයකටම 80% මෙතනෝල් මිලි ලීටර් 1 ක් එකතු කර, පසුව ද්‍රව නයිට්‍රජන් තුළ සුළි සුළං කර ස්නැප් ශීත කරන ලදී. සාම්පල කැටි-දියවන චක්‍ර තුනකට භාජනය කර 4°C දී මිනිත්තු 15 ක් 14,000 rpm දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. පරිවෘත්තීය අඩංගු සුපිරි ද්‍රව්‍ය වියළී යන තෙක් වාෂ්ප වී යයි. පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය 0.03% ෆෝමික් අම්ලයේ 50 μl හි නැවත විසුරුවා හැර, මිශ්‍ර කිරීමට සුළි සුළං කර, පසුව සුන්බුන් ඉවත් කිරීම සඳහා කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී.
ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය නිස්සාරණය කරන්න. පරිවෘත්තීය පර්යේෂණ සඳහා අධි ක්‍රියාකාරී ද්‍රව වර්ණදේහ බෝතලයකට සුපිරි ද්‍රව්‍ය මාරු කරන්න. කාණ්ඩ බලපෑම් වැළැක්වීම සඳහා සෑම සාම්පලයකටම සමාන සෛල සංඛ්‍යාවක් සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා අහඹු ප්‍රතිකාර ප්‍රොටෝකෝලයක් භාවිතා කරන්න. AB SCIEX QTRAP 5500 ත්‍රිත්ව චතුරස්‍ර ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (50) හි කලින් ප්‍රකාශයට පත් කරන ලද ගෝලීය පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවල ගුණාත්මක තක්සේරුවක් අපි සිදු කළෙමු. වර්ණදේහ විශ්ලේෂණය සහ උච්ච ප්‍රදේශ ඒකාබද්ධ කිරීම MultiQuant අනුවාදය 2.1 මෘදුකාංගය (Applied Biosystems SCIEX) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.
අතුරුදහන් වූ පරිවෘත්තීය අගය ඇස්තමේන්තු කිරීම සඳහා 1000 ක අයන සංඛ්‍යාවක් භාවිතා කරන ලද අතර, එක් එක් සාම්පලයේ TIC, සාම්පල සැකසීමෙන් උපකරණ විශ්ලේෂණය මගින් හඳුන්වා දුන් වෙනස්කම් නිවැරදි කිරීම සඳහා එක් එක් අනාවරණය කරගත් පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයේ සාමාන්‍යකරණය කළ උච්ච ප්‍රදේශය ගණනය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. TIC සාමාන්‍යකරණය කිරීමෙන් පසු, MetaboAnalystR(51) (පෙරනිමි පරාමිතිය) ලඝුගණක පරිවර්තනය සහ ස්වයංක්‍රීය සම්මත රේඛා පරිමාණය සඳහා භාවිතා කරයි. සාම්පල වර්ග අතර පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් පිළිබඳ ගවේෂණාත්මක විශ්ලේෂණයක් සිදු කිරීම සඳහා අපි වීගන් R පැකේජය සමඟ PCA භාවිතා කළ අතර, රෝගීන් විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා අර්ධ අතිරික්තතා විශ්ලේෂණය භාවිතා කළෙමු. සාම්පල අතර යුක්ලීඩියානු දුර පොකුරු කිරීම සඳහා තාප සිතියම් ඩෙන්ඩ්‍රොග්‍රෑම් එකක් තැනීමට වෝඩ් ක්‍රමය භාවිතා කරන්න. සමස්ත සෛල වර්ගය සහ ක්ෂුද්‍ර පරිසරය හරහා වෙනස් ලෙස බහුල පරිවෘත්තීය හඳුනා ගැනීම සඳහා අපි ප්‍රමිතිගත පරිවෘත්තීය බහුලත්වය මත ලිම්මා (52) භාවිතා කළෙමු. පැහැදිලි කිරීම සරල කිරීම සඳහා, අපි ආකෘතිය නියම කිරීමට කණ්ඩායම් මධ්‍යන්‍ය පරාමිතිය භාවිතා කරන අතර, ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ සෛල වර්ග එක් එක් කණ්ඩායම ලෙස සලකා බලමු (n = 6 කණ්ඩායම්); වැදගත්කම පරීක්ෂණය සඳහා, අපි එක් එක් පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යය සඳහා නැවත නැවත මිනුම් තුනක් සිදු කළෙමු. ව්‍යාජ අනුරූකරණය වළක්වා ගැනීම සඳහා, රෝගියා ලිම්මා නිර්මාණයේ බාධාවක් ලෙස ඇතුළත් කරන ලදී. විවිධ රෝගීන් අතර පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවල වෙනස්කම් පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි රෝගීන් ඇතුළුව ලිම්මා ආකෘතිය ස්ථාවර ආකාරයකින් සකස් කළෙමු. සෛල වර්ගය සහ Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg නිවැරදි කිරීම) හි ක්ෂුද්‍ර පරිසරය අතර පූර්ව නිශ්චිත වෙනසෙහි වැදගත්කම අපි වාර්තා කරමු.
මිල්ටෙනි මළ සෛල ඉවත් කිරීමේ කට්ටලය (> 80% ශක්‍යතාව) භාවිතයෙන් ශක්තිය පොහොසත් කිරීමෙන් පසු, 10x 5′ජාන ප්‍රකාශන ප්‍රොටෝකෝලයක් භාවිතා කරමින් මුළු සජීවී ශීත කළ ඇස්කයිට් සහ පිළිකා සාම්පල මත තනි සෛල පිටපත් කිරීමේ අනුක්‍රමණය සිදු කරන ලදී. ගැලපෙන පිළිකා සහ ඇස්කයිට් සහිත අවස්ථා පහක් විශ්ලේෂණය කරන ලද නමුත්, එක් පිළිකා සාම්පලයකින් අඩු ශක්‍යතාව එහි ඇතුළත් කිරීම වැළැක්වීය. රෝගීන්ගේ බහු තේරීම් ලබා ගැනීම සඳහා, අපි 10x ක්‍රෝමියම් පාලකයේ මංතීරුවල එක් එක් රෝගියාගේ සාම්පල ඒකාබද්ධ කර, ඇස්කයිට් සහ පිළිකා ස්ථාන වෙන වෙනම විශ්ලේෂණය කළෙමු. අනුපිළිවෙලින් පසු [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp යුගල අන්තය (PE), Quebec genome; පිළිකා සහ ඇස්කයිට් සඳහා සෛලයකට සාමාන්‍යයෙන් 73,488 සහ 41,378 කියවීම්]], අපි CellSNP සහ Vireo (53) භාවිතා කළෙමු (CellSNP මත පදනම්ව GRCh38 විසින් සපයන ලද පොදු මානව SNP (VCF) පරිත්‍යාගශීලීන්ගේ අනන්‍යතාවයක් පවරා ඇත. ඩුප්ලෙක්ස් ලෙස හඳුනාගෙන ඇති පවරා නොගත් සෛල සහ සෛල සහ ඇස්කයිට් සහ පිළිකා සාම්පල අතර ගැලපෙන පරිත්‍යාගශීලීන් හැර, රෝගියාගේ ප්‍රවේණික තත්ත්වයේ (IBS) සමීපතම අනන්‍යතාවය (IBS) අනුමාන කිරීමට අපි SNPRelate භාවිතා කරමු (54). මෙම කාර්යයේ පදනම මත, අපි පහළට විශ්ලේෂණය සඳහා පිළිකා සහ ඇස්කයිට් වල බහුල සෛල නිරූපණයක් සහිත අවස්ථා තුනක් රඳවා ගත්තෙමු. ස්කැටර් (55) සහ ස්කන් (56) ජෛව සන්නායක ඇසුරුම්වල ස්කන්ධ පෙරීමේ පියවරක් සිදු කිරීමෙන් පසු, මෙය විශ්ලේෂණය සඳහා සෛල 6975 ක් (පිළිවෙලින් පිළිකා සහ ඇස්කයිට් වලින් සෛල 2792 සහ 4183) ලබා දුන්නේය. අපි බෙදාගත් ළඟම අසල්වැසි ජාලයේ (SNN) igraph හි (57) Louvain පොකුරු භාවිතා කරමු. ප්‍රකාශනය අනුව පොකුරු සෛල වලට ජැකාර්ඩ් දුර මත පදනම්ව. සලකුණු ජාන ප්‍රකාශනය මත පදනම්ව අනුමාන සෛල වර්ග වලට පොකුරු අතින් විවරණය කර t-SNE සමඟ දෘශ්‍යමාන කරන ලදී. සයිටොටොක්සික් ටී සෛල CD8A සහ GZMA ප්‍රකාශනය මගින් අර්ථ දක්වා ඇති අතර, අඩු රයිබසෝම ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනයක් සහිත උප පොකුරු හැර. ඉසාර් සහ වෙනත් අයගේ ප්‍රකාශිත දත්ත වෙත අපි ප්‍රවේශ වූ අතර (16), ඒවායේ t-SNE කාවැද්දීම ඇතුළුව, ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල සලකුණු සහ NNMT ප්‍රකාශනය අතර ප්‍රකාශන අතිච්ඡාදනය පාලනය කළ හැකිය.
Ficoll අනුක්‍රමික ඝනත්ව කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් ලියුකෝසයිට් වෙන් කිරීමේ නිෂ්පාදන (STEMCELL Technologies) වලින් PBMC වෙන් කරන ලදී. CD3 පබළු (Miltenyi) භාවිතයෙන් CD3 + සෛල PBMC වලින් හුදකලා කරන ලදී. MNA තිබීම හෝ නොමැති විට, CD3+ සෛල තහඩු-බැඳුණු CD3 (5μg/ml), ද්‍රාව්‍ය CD28 (3μg/ml) සහ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) සමඟ සක්‍රිය කරන ලදී. ප්‍රසාරණයේ අවසාන දිනයේදී, ශක්‍යතාව (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) සහ ප්‍රගුණනය (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මගින් ඇගයීමට ලක් කරන ලදී. GolgiStop සමඟ පැය 4ක් PMA (20 ng/ml) සහ අයනොමයිසින් (1μg/ml) සහිත සෛල උත්තේජනය කිරීමෙන් ඵලදායි ක්‍රියාකාරිත්වය ඇගයීමට ලක් කරන්න, සහ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) සහ TNFα-ෆ්ලෝරසෙයින් අයිසෝතියෝසයනේට් (FITC) (MAb11, BD) නිරීක්ෂණය කරන්න. PMA (20 ng/ml) සහ අයනොමයිසින් (1μg/ml) සමඟ පැය 4ක් qPCR සහ ChIP සෛල උත්තේජනය කරන්න. PMA (20 ng/ml) සහ අයනොමයිසින් (1 μg/ml) සමඟ උත්තේජනයට පෙර සහ පසු ELISA සුපර්නේටන්ට් පැය 4ක් එකතු කරන ලදී.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) භාවිතයෙන් RNA හුදකලා කිරීමට නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුගමනය කරන්න. නියැදිය සමජාතීය කිරීමට QIAshredder (QIAGEN) භාවිතා කරන්න. අනුපූරක DNA (cDNA) සංස්ලේෂණය කිරීමට ඉහළ ධාරිතාවයකින් යුත් RNA සිට cDNA කට්ටලය (Thermo Fisher Scientific) භාවිතා කරන්න. පහත පරීක්ෂණ සමඟ ජාන ප්‍රකාශනය ප්‍රමාණනය කිරීමට (නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව) TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) භාවිතා කරන්න: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] සහ Hs01010726_m1 (SLC22A2). සාම්පල MicroAmp දෘශ්‍ය පටලයක් සහිත MicroAmp වේගවත් දෘශ්‍ය 96-ළිං ප්‍රතික්‍රියා තහඩුවේ (Applied Biosystems) StepOnePlus තත්‍ය කාලීන PCR පද්ධතිය (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) මත ධාවනය කරන ලදී. 35 ඉක්මවන ඕනෑම Ct අගයක් හඳුනාගැනීමේ සීමාවට ඉහළින් ඇති බව සලකනු ලබන අතර එය හඳුනාගත නොහැකි ලෙස සලකුණු කර ඇත.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි ChIP සිදු කරන්න (58). කෙටියෙන් කිවහොත්, සෛල ෆෝමල්ඩිහයිඩ් (අවසාන සාන්ද්‍රණය 1.42%) සමඟ ප්‍රතිකාර කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 10 ක් ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. අයිස් මත මිනිත්තු 10 ක් සඳහා අතිරේක ඉදිමීමේ බෆරය (25 mM හෙප්ස්, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl සහ 0.1% NP-40) භාවිතා කරන්න, පසුව විස්තර කර ඇති පරිදි ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණ බෆරයේ නැවත සවි කරන්න (58). ඉන්පසු නියැදිය පහත චක්‍ර සමඟ ශබ්ද කරන ලදී: චක්‍ර 10 (තත්පර 1 ස්පන්දන 20) සහ තත්පර 40 ක ස්ථිතික කාලයක්. ChIP-ශ්‍රේණියේ ඉමියුනොග්ලොබුලින් G (සෛල සංඥා තාක්ෂණය; 1μl), හිස්ටෝන් H3 (සෛල සංඥා තාක්ෂණය; 3μl), NFAT (ඉන්විට්‍රජන්; 3μl) සහ SP1 (සෛල සංඥා තාක්ෂණය; 3μl) ප්‍රතිදේහ 4°CC සෙලවීමේදී එක රැයකින් සාම්පලය සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන්න. ප්‍රෝටීන් A පබළු (Thermo Fisher Scientific) සාම්පලය සමඟ 4°C උෂ්ණත්වයකදී පැය 1ක් මෘදු සෙලවීමකින් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන්න, ඉන්පසු DNA පොහොසත් කිරීමට චෙලෙක්ස් පබළු (Bio-Rad) භාවිතා කරන්න, සහ ප්‍රෝටීන් ජීර්ණය සඳහා ප්‍රෝටීනේස් K (Thermo Fisher) භාවිතා කරන්න. TNFα ප්‍රවර්ධකය PCR මගින් අනාවරණය කර ගන්නා ලදී: ඉදිරියට, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp නිෂ්පාදනය). රූප Image Lab (Bio-Rad) විසින් නිෂ්පාදනය කරන ලද අතර ImageJ මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් ප්‍රමාණනය කරන ලදී.
ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි සෛල සංස්කෘතික අධිතාක්ෂණ ද්‍රව්‍යය එකතු කරන ලදී. මානව TNFα ELISA කට්ටලය (Invitrogen), මානව IL-2 ELISA කට්ටලය (Invitrogen) සහ මානව IFN-γ ELISA කට්ටලය (Abcam) යන නිෂ්පාදකයාගේ ක්‍රියා පටිපාටිවලට අනුව නිර්ණය කිරීම සිදු කරන ලදී. නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලයට අනුව, TNFα සහ IL-2 හඳුනා ගැනීම සඳහා සුපිරිතාක්ෂණ ද්‍රව්‍යය 1:100 සහ IFN-γ හඳුනා ගැනීම සඳහා 1:3 තනුක කරන ලදී. 450 nm හි අවශෝෂණය මැනීමට EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) භාවිතා කරන්න.
ෆිකෝල් අනුක්‍රමික ඝනත්ව කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් ලියුකෝසයිට් වෙන් කිරීමේ නිෂ්පාදන (STEMCELL Technologies) වලින් PBMC වෙන් කරන ලදී. CD3 පබළු (Miltenyi) භාවිතයෙන් CD3 + සෛල PBMC වලින් හුදකලා කරන ලදී. MNA තිබීම හෝ නොමැති විට, CD3+ සෛල තහඩු-බැඳුණු CD3 (5μg/ml), ද්‍රාව්‍ය CD28 (3μg/ml) සහ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) සමඟ දින 3 ක් සක්‍රිය කරන ලදී. දින 3 කට පසු, සෛල එකතු කර 0.9% සේලයින් වලින් සෝදා, පෙති ක්ෂණිකව ශීත කරන ලදී. 123count eBeads භාවිතා කරමින් ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R වින්‍යාසය) මගින් සෛල ගණන සිදු කරන ලදී.
ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය නිස්සාරණය කරන්න. වියලන ලද සාරය සෛල සමානකම් 4000/μl සාන්ද්‍රණයකින් නැවත සකස් කරන ලදී. ප්‍රතිලෝම-අදියර වර්ණදේහ විද්‍යාව (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) සහ CORTECS T3 තීරුව (2.1×150 mm, අංශු ප්‍රමාණය 1.6-μm, සිදුරු ප්‍රමාණය 120-Å; #186008500, Waters) මගින් නියැදිය විශ්ලේෂණය කරන්න. ධ්‍රැවීය ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (6470, Agilent), එහි විද්‍යුත් ඉසින අයනීකරණය ධනාත්මක ආකාරයෙන් ක්‍රියාත්මක වේ. ජංගම අදියර A යනු 0.1% ෆෝමික් අම්ලය (H2O හි), ජංගම අදියර B යනු 90% ඇසිටොනයිට්‍රයිල්, 0.1% ෆෝමික් අම්ලයයි. LC අනුක්‍රමණය 100% A සඳහා මිනිත්තු 0 සිට 2 දක්වාද, 99% B සඳහා මිනිත්තු 2 සිට 7.1 දක්වාද, 99% B සඳහා මිනිත්තු 7.1 සිට 8 දක්වාද වේ. ඉන්පසු තීරුව ජංගම අදියර A සමඟ මිනිත්තු 3ක් සඳහා 0.6 ml/min ප්‍රවාහ අනුපාතයකින් නැවත සමතුලිත කරන්න. ප්‍රවාහ අනුපාතය 0.4ml/min වන අතර, තීරු කුටිය 50°C දක්වා රත් කරනු ලැබේ. රඳවා ගැනීමේ කාලය (RT) සහ පරිවර්තනය (RT = 0.882 මිනිත්තු, පරිවර්තනය 1 = 137→94.1, පරිවර්තනය 2 = 137→92, පරිවර්තනය 3 = 137→78) ස්ථාපිත කිරීමට MNA හි පිරිසිදු රසායනික ප්‍රමිතිය (M320995, ටොරොන්ටෝ පර්යේෂණ රසායනික සමාගම, උතුරු යෝර්ක්, ඔන්ටාරියෝ, කැනඩාව) භාවිතා කරන්න. සංක්‍රාන්ති තුනම නිවැරදි රඳවා ගැනීමේ වේලාවේදී සිදු වූ විට, නිශ්චිතභාවය සහතික කිරීම සඳහා ප්‍රමාණනය සඳහා සංක්‍රාන්ති 1 භාවිතා කරයි. MNA (ටොරොන්ටෝ පර්යේෂණ රසායනික සමාගම) හි සම්මත වක්‍රය, පිළිවෙලින් 0.1, 1.0, 10 සහ 100 ng/ml සහ 1.0 සහ 10μg/ml ප්‍රමිතීන් ලබා ගැනීම සඳහා තොග ද්‍රාවණය (1 mg/ml) අනුක්‍රමික තනුක කිරීම් හයක් මගින් ජනනය කරන ලදී. හඳුනාගැනීමේ සීමාව 1 ng/ml වන අතර, රේඛීය ප්‍රතිචාරය 10 ng/ml සහ 10μg/ml අතර වේ. සාම්පලයේ සහ ප්‍රමිතියේ මයික්‍රොලීටර් දෙකක එක් එක් එන්නත් කිරීම LC/MS විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන අතර, විශ්ලේෂණ වේදිකාවේ ස්ථායිතාව සහතික කිරීම සඳහා මිශ්‍ර තත්ත්ව පාලන සාම්පලයක් සෑම එන්නත් අටකටම වරක් ක්‍රියාත්මක වේ. සියලුම MNA-ප්‍රතිකාර කළ සෛල සාම්පලවල MNA ප්‍රතිචාර විශ්ලේෂණයේ රේඛීය පරාසය තුළ විය. MassHunter ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණ මෘදුකාංගය (v9.0, Agilent) භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
දෙවන පරම්පරාවේ αFR-CAR නිර්මාණය Song et al. (59) ගෙන් ලබා ගන්නා ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, නිර්මාණයේ පහත අන්තර්ගතයන් අඩංගු වේ: CD8a නායක අනුපිළිවෙල, මානව αFR-විශේෂිත තනි දාම විචල්‍ය කොටස, CD8a hinge සහ transmembrane කලාපය, CD27 අන්තර් සෛලීය වසම සහ CD3z අන්තර් සෛලීය වසම. සම්පූර්ණ CAR අනුපිළිවෙල GenScript මගින් සංස්ලේෂණය කරන ලද අතර, පසුව සම්ප්‍රේෂණ කාර්යක්ෂමතාව ඇගයීමට භාවිතා කරන GFP ප්‍රකාශන කැසට් පටයේ ඉහළට දෙවන පරම්පරාවේ ලෙන්ටිවයිරල් ප්‍රකාශන දෛශිකයට ක්ලෝන කරන ලදී.
ලෙන්ටිවයිරසය නිපදවනු ලබන්නේ HEK293T සෛල සම්ප්‍රේෂණය කිරීමෙනි [ඇමරිකානු වර්ගයේ සංස්කෘතික එකතුව (ATCC); 10% භ්‍රෑණ බෝවින් සෙරුමය (FBS) සහ 1% PenStrep අඩංගු Dulbecco හි නවීකරණය කරන ලද ඊගල් මාධ්‍යයේ වගා කර CAR-GFP දෛශිකය භාවිතා කරන අතර ඇසුරුම් ප්ලාස්මිඩ් (psPAX2 සහ pMD2.G, Addgene) ලිපොෆෙක්ෂන් ඇමයින් (සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) භාවිතා කරයි. සම්ප්‍රේෂණයෙන් පැය 48 සහ 72 කට පසු වෛරස් අඩංගු සුපර්නැටන්ට් එකතු කර, අල්ට්‍රා කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් සාන්ද්‍රණය කරන ලදී. සාන්ද්‍රිත වෛරස් සුපර්නැටන්ට් -80°C දී සම්ප්‍රේෂණය වන තෙක් ගබඩා කරන්න.
PBMC නිරෝගී පරිත්‍යාගශීලී ලියුකෝසයිට් වෙන් කිරීමේ නිෂ්පාදන (STEMCELL Technologies) වලින් Ficoll අනුක්‍රමික ඝනත්ව කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් වෙන් කරනු ලැබේ. PBMC වලින් CD8+ සෛල හුදකලා කිරීමට ධනාත්මක තේරීම් CD8 ක්ෂුද්‍ර පබළු (Miltenyi) භාවිතා කරන්න. T සෛල TransAct (Miltenyi) සහ TexMACS මාධ්‍යයෙන් උත්තේජනය කරන්න [Miltenyi; 3% තාප-අක්‍රිය කළ මිනිස් සෙරුමය, 1% PenStrep සහ IL-2 (300 U/ml) සමඟ අතිරේකව]. උත්තේජනයෙන් පැය විසිහතරකට පසු, T සෛල ලෙන්ටිවයිරස් (සෛල 106 කට 10 μl සාන්ද්‍රිත වෛරස් සුපර්නේටන්ට්) සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලදී. Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ මත සම්ප්‍රේෂණයෙන් දින 1 සිට 3 දක්වා, අවම වශයෙන් 30% ක සම්ප්‍රේෂණ කාර්යක්ෂමතාවයක් පෙන්නුම් කිරීම සඳහා සෛලවල GFP ප්‍රකාශනය ඇගයීමට ලක් කරන්න.
CAR-T සෛල පැය 24ක් Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep සමඟ අතිරේකව) තුළ වගා කරන ලදී, පහත සඳහන් කොන්දේසි යටතේ: ප්‍රතිකාර නොකළ, 250 μM ඇඩෙනොසීන් හෝ 10 mM MNA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලදී. පූර්ව ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු, CAR-T සෛල PBS සමඟ සෝදා SK-OV-3 සෛල 20,000ක් සමඟ ඒකාබද්ධ කරන ලදී [ATCC; McCoy 5A මාධ්‍යයේ (Sigma-Aldrich) 10% FBS සහ 1% PenStrep සමඟ අතිරේකව 10: 1 හි ඉලක්කගත අනුපාතයට ඵලදායිකය අතිරේක Immunocult මාධ්‍යයේ ත්‍රිත්ව වලින් විස්තාරණය කරන ලදී. SK-OV-3 සෛල සහ ඩිජිටල් සැපෝනින් (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) සමඟ ලයිස් කරන ලද SK-OV-3 සෛල පිළිවෙලින් සෘණ සහ ධනාත්මක පාලනයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. පැය 24ක සම-වගා කිරීමෙන් පසු, සුපිරි ද්‍රව්‍යය එකතු කර නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව ලැක්ටේට් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් (LDH) මනිනු ලැබීය (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH සුපිරි ද්‍රව්‍යය LDH බෆරයේ 1:50 කින් තනුක කරන ලදී. මරා දැමීමේ ප්‍රතිශතය පහත සූත්‍රය භාවිතයෙන් මනිනු ලැබීය: මරා දැමීමේ ප්‍රතිශතය = නිවැරදි කිරීමේ ප්‍රතිශතය / උපරිම මරණ අනුපාතය x 100%, එහිදී නිවැරදි කිරීමේ ප්‍රතිශතය = සම-සංස්කෘතික-T සෛල පමණි, සහ උපරිම මරණ අනුපාතය = ධනාත්මක පාලනය-සෘණ පාලනය.
පෙළෙහි හෝ ද්‍රව්‍ය හා ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි, සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා GraphPad Prism 8, Microsoft Excel හෝ R v3.6.0 භාවිතා කරන්න. එකම රෝගියාගෙන් (ඇසයිට් සහ ගෙඩියක් වැනි) සාම්පල කිහිපයක් එකතු කර ඇත්නම්, අපි යුගල කළ t පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරමු හෝ සුදුසු පරිදි රේඛීය හෝ සාමාන්‍යකරණය කළ ආකෘතියක අහඹු බලපෑමක් ලෙස රෝගියා ඇතුළත් කරමු. පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය සඳහා, වැදගත්කම පරීක්ෂණය ත්‍රිත්ව ආකාරයෙන් සිදු කෙරේ.
මෙම ලිපිය සඳහා අතිරේක ද්‍රව්‍ය සඳහා, කරුණාකර http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 බලන්න.
මෙය Creative Commons Attribution-Non-Commercial බලපත්‍රයේ නියමයන් යටතේ බෙදා හරින ලද විවෘත ප්‍රවේශ ලිපියකි, එය අවසාන භාවිතය වාණිජමය වාසි සඳහා නොවන තාක් කල් සහ මුල් කෘතිය නිවැරදි බව උපකල්පනය කරන තාක් කල්, ඕනෑම මාධ්‍යයකින් භාවිතය, බෙදා හැරීම සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීමට ඉඩ සලසයි. යොමුව.
සටහන: අපි ඔබෙන් ඉල්ලා සිටින්නේ ඔබගේ විද්‍යුත් තැපැල් ලිපිනය ලබා දෙන ලෙසයි, එවිට ඔබ පිටුවට නිර්දේශ කරන පුද්ගලයාට ඔබට විද්‍යුත් තැපෑල දැකීමට අවශ්‍ය බවත් එය ස්පෑම් නොවන බවත් දැනගත හැකිය. අපි කිසිදු විද්‍යුත් තැපැල් ලිපිනයක් ග්‍රහණය නොකරමු.
ඔබ අමුත්තෙකු දැයි පරීක්ෂා කිරීමට සහ ස්වයංක්‍රීය ස්පෑම් ඉදිරිපත් කිරීම වැළැක්වීමට මෙම ප්‍රශ්නය භාවිතා කරයි.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (J.Brad Nelson), J.Brad Nelson (J.Brad Nelson), (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA, T සෛලවල ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දනයට දායක වන අතර මිනිස් පිළිකා සඳහා ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා විභව ප්‍රතිශක්තිකරණ චිකිත්සක ඉලක්කයක් නියෝජනය කරයි.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (J.Brad Nelson), J.Brad Nelson (J.Brad Nelson), (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA, T සෛලවල ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දනයට දායක වන අතර මිනිස් පිළිකා සඳහා ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා විභව ප්‍රතිශක්තිකරණ චිකිත්සක ඉලක්කයක් නියෝජනය කරයි.
©2021 විද්‍යාවේ දියුණුව සඳහා වූ ඇමරිකානු සංගමය. සියලු හිමිකම් ඇවිරිණි. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef සහ COUNTER හි හවුල්කරුවෙකි. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.