දිලීර නාශක කාරකයක් සහ පොදු ආහාර ආකලන ද්‍රව්‍යයක් වන ප්‍රොපියොනික් අම්ලය (PPA), මීයන් තුළ අසාමාන්‍ය ස්නායු සංවර්ධනයක් ඇති කරන බව පෙන්වා දී ඇති අතර, එය බඩවැල් ඩිස්බියෝසිස් නිසා ඇති විය හැක. ආහාරමය PPA නිරාවරණය සහ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව ඩිස්බියෝසිස් අතර සම්බන්ධයක් යෝජනා කර ඇත, නමුත් සෘජුව විමර්ශනය කර නොමැත. මෙහිදී, අපි බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව සංයුතියේ PPA ආශ්‍රිත වෙනස්කම් විමර්ශනය කළ අතර එය ඩිස්බියෝසිස් වලට හේතු විය හැක. ප්‍රතිකාර නොකළ ආහාර වේලක් (n=9) සහ PPA-පොහොසත් ආහාර වේලක් (n=13) ලබා දුන් මීයන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවීන් ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියේ සහ බැක්ටීරියා පරිවෘත්තීය මාර්ගවල වෙනස්කම් තක්සේරු කිරීම සඳහා දිගු දුර මෙටජෙනොමික් අනුක්‍රමණය භාවිතයෙන් අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී. ආහාරමය PPA, බැක්ටීරොයිඩ්, ප්‍රෙවොටෙල්ලා සහ රුමිනොකොකස් විශේෂ කිහිපයක් ඇතුළුව සැලකිය යුතු ටැක්සා බහුලත්වයේ වැඩිවීමක් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති අතර, ඒවායේ සාමාජිකයින් මීට පෙර PPA නිෂ්පාදනයට සම්බන්ධ වී ඇත. PPA-නිරාවරණය වූ මීයන්ගේ ක්ෂුද්‍රජීවීන්ට ලිපිඩ පරිවෘත්තීය හා ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන ජෛව සංස්ලේෂණයට අදාළ තවත් මාර්ග තිබුණි. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ PPA හට බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව සහ ඒ ආශ්‍රිත පරිවෘත්තීය මාර්ග වෙනස් කළ හැකි බවයි. මෙම නිරීක්ෂණය කරන ලද වෙනස්කම් මගින් අවධාරණය කරනුයේ පරිභෝජනයට ආරක්ෂිත යැයි වර්ගීකරණය කරන ලද කල් තබා ගන්නා ද්‍රව්‍ය බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ සංයුතියට සහ අනෙක් අතට මිනිස් සෞඛ්‍යයට බලපෑම් කළ හැකි බවයි.
මිනිස් ක්ෂුද්‍රජීවය බොහෝ විට "ශරීරයේ අවසාන ඉන්ද්‍රිය" ලෙස හඳුන්වන අතර මිනිස් සෞඛ්‍යයට වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි (Baquero සහ Nombela, 2012). විශේෂයෙන්, බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවය එහි පද්ධතිමය බලපෑම සහ අත්‍යවශ්‍ය කාර්යයන් රාශියක භූමිකාව සඳහා පිළිගැනේ. කොමෙන්සල් බැක්ටීරියා බඩවැලේ බහුලව දක්නට ලැබෙන අතර, බහු පාරිසරික ස්ථාන අල්ලා ගනිමින්, පෝෂ්‍ය පදාර්ථ භාවිතා කරමින් සහ විභව රෝග කාරක සමඟ තරඟ කරයි (Jandhyala et al., 2015). බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ විවිධ බැක්ටීරියා සංරචක විටමින් වැනි අත්‍යවශ්‍ය පෝෂ්‍ය පදාර්ථ නිපදවීමට සහ ආහාර දිරවීම ප්‍රවර්ධනය කිරීමට සමත් වේ (Rowland et al., 2018). බැක්ටීරියා පරිවෘත්තීය පටක වර්ධනයට බලපෑම් කරන බවත් පරිවෘත්තීය හා ප්‍රතිශක්තිකරණ මාර්ග වැඩි දියුණු කරන බවත් පෙන්වා දී ඇත (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). මිනිස් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ සංයුතිය අතිශයින්ම විවිධාකාර වන අතර ආහාර, ස්ත්‍රී පුරුෂ භාවය, ඖෂධ සහ සෞඛ්‍ය තත්ත්වය වැනි ජානමය සහ පාරිසරික සාධක මත රඳා පවතී (Kumbhare et al., 2019).
මාතෘ ආහාර වේල යනු කලලරූපී සහ අලුත උපන් බිළිඳුන්ගේ වර්ධනයේ තීරණාත්මක අංගයක් වන අතර වර්ධනයට බලපෑම් කළ හැකි සංයෝගවල උපකල්පිත ප්‍රභවයකි (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). එවැනි උනන්දුවක් දක්වන සංයෝගයක් වන්නේ බැක්ටීරියා පැසවීමෙන් සහ ආහාර ආකලන ද්‍රව්‍යයකින් ලබාගත් කෙටි දාම මේද අම්ල අතුරු නිෂ්පාදනයක් වන ප්‍රොපියොනික් අම්ලය (PPA) සහ (den Besten et al., 2013) ය. PPA හි ප්‍රතිබැක්ටීරීය සහ ප්‍රති-දිලීර ගුණ ඇති අතර එම නිසා ආහාර කල් තබා ගන්නා ද්‍රව්‍යයක් ලෙස සහ අච්චු සහ බැක්ටීරියා වර්ධනය වැළැක්වීම සඳහා කාර්මික යෙදුම්වල භාවිතා වේ (Wemmenhove et al., 2016). PPA විවිධ පටක වල විවිධ බලපෑම් ඇති කරයි. අක්මාව තුළ, මැක්‍රෝෆේජ් වල සයිටොකයින් ප්‍රකාශනයට බලපෑම් කිරීමෙන් PPA ප්‍රති-ගිනි අවුලුවන බලපෑම් ඇති කරයි (Kawasoe et al., 2022). මෙම නියාමන බලපෑම අනෙකුත් ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල තුළ ද නිරීක්ෂණය කර ඇති අතර, එය දැවිල්ල අඩු කිරීමට හේතු වේ (Haase et al., 2021). කෙසේ වෙතත්, මොළයේ ප්‍රතිවිරුද්ධ බලපෑම නිරීක්ෂණය කර ඇත. පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ PPA නිරාවරණය මීයන් තුළ ඔටිසම් වැනි හැසිරීම් ඇති කරන බවයි (El-Ansary et al., 2012). අනෙකුත් අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ PPA මගින් ග්ලියෝසිස් ඇති කළ හැකි අතර මොළයේ ගිනි අවුලුවන මාර්ග සක්‍රීය කළ හැකි බවයි (Abdelli et al., 2019). PPA දුර්වල අම්ලයක් බැවින්, එය බඩවැල් එපිටිලියම් හරහා රුධිර ප්‍රවාහයට විසරණය විය හැකි අතර එමඟින් රුධිර-මොළයේ බාධකය මෙන්ම වැදෑමහ ඇතුළු සීමාකාරී බාධක තරණය කළ හැකිය (Stinson et al., 2019), බැක්ටීරියා මගින් නිපදවන නියාමන පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයක් ලෙස PPA හි වැදගත්කම ඉස්මතු කරයි. ඔටිසම් සඳහා අවදානම් සාධකයක් ලෙස PPA හි විභව භූමිකාව දැනට විමර්ශනය වෙමින් පවතී, නමුත් ඔටිසම් රෝගයෙන් පෙළෙන පුද්ගලයින්ට එහි බලපෑම් ස්නායු අවකලනය ඇති කිරීමට වඩා දිගු විය හැකිය.
ස්නායු සංවර්ධන ආබාධ සහිත රෝගීන් තුළ පාචනය සහ මලබද්ධය වැනි ආමාශ ආන්ත්‍රික රෝග ලක්ෂණ බහුලව දක්නට ලැබේ (Cao et al., 2021). ඔටිසම් වර්ණාවලී ආබාධ (ASD) ඇති රෝගීන්ගේ ක්ෂුද්‍රජීවකය නිරෝගී පුද්ගලයින්ගේ ක්ෂුද්‍රජීවයට වඩා වෙනස් බව පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇති අතර, එමඟින් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවක ඩිස්බියෝසිස් පවතින බව යෝජනා කරයි (Finegold et al., 2010). ඒ හා සමානව, ගිනි අවුලුවන බඩවැල් රෝග, තරබාරුකම, ඇල්සයිමර් රෝගය ආදිය ඇති රෝගීන්ගේ ක්ෂුද්‍රජීව ලක්ෂණ ද නිරෝගී පුද්ගලයින්ගේ ලක්ෂණවලට වඩා වෙනස් වේ (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). කෙසේ වෙතත්, අද වන විට, බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවකය සහ ස්නායු රෝග හෝ රෝග ලක්ෂණ අතර කිසිදු හේතු සම්බන්ධතාවයක් ස්ථාපිත කර නොමැත (Yap et al., 2021), නමුත් මෙම රෝග තත්වයන්ගෙන් සමහරක් සඳහා බැක්ටීරියා විශේෂ කිහිපයක් භූමිකාවක් ඉටු කරන බව සැලකේ. උදාහරණයක් ලෙස, අක්කර්මන්සියා, බැක්ටීරොයිඩ්ස්, ක්ලොස්ට්‍රිඩියම්, ලැක්ටොබැසිලස්, ඩෙසල්ෆොවිබ්‍රියෝ සහ අනෙකුත් ගණයන් ඔටිසම් රෝගීන්ගේ ක්ෂුද්‍රජීවකවල බහුලව දක්නට ලැබේ (ටොමෝවා සහ වෙනත් අය, 2015; ගොලුබෙවා සහ වෙනත් අය, 2017; ක්‍රිස්ටියානෝ සහ වෙනත් අය, 2018; සූරිටා සහ වෙනත් අය, 2020). විශේෂයෙන්, මෙම ගණවල සමහර සාමාජික විශේෂවලට PPA නිෂ්පාදනය හා සම්බන්ධ ජාන ඇති බව දන්නා කරුණකි (රීචාර්ඩ් සහ වෙනත් අය, 2014; යුන් සහ ලී, 2016; ෂැං සහ වෙනත් අය, 2019; බෝර් සහ ඩුරේ, 2023). PPA හි ක්ෂුද්‍ර ජීවී නාශක ගුණාංග සැලකිල්ලට ගෙන, එහි බහුලත්වය වැඩි කිරීම PPA නිපදවන බැක්ටීරියා වර්ධනයට ප්‍රයෝජනවත් විය හැකිය (ජේකොබ්සන් සහ වෙනත් අය, 2018). මේ අනුව, PFA බහුල පරිසරයක් ආමාශ ආන්ත්‍රික රෝග කාරක ඇතුළුව බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවකවල වෙනස්කම් වලට හේතු විය හැක, එය ආමාශ ආන්ත්‍රික රෝග කාරක වලට තුඩු දෙන විභව සාධක විය හැකිය.
ක්ෂුද්‍රජීව පර්යේෂණයේ කේන්ද්‍රීය ප්‍රශ්නයක් වන්නේ ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියේ වෙනස්කම් යටින් පවතින රෝග සඳහා හේතුවක් හෝ රෝග ලක්ෂණයක්ද යන්නයි. ආහාර, බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවය සහ ස්නායු රෝග අතර සංකීර්ණ සම්බන්ධතාවය පැහැදිලි කිරීමේ පළමු පියවර වන්නේ ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියට ආහාරයේ බලපෑම් තක්සේරු කිරීමයි. මේ සඳහා, PPA-පොහොසත් හෝ PPA-ක්ෂය වූ ආහාරයක් ලබා දුන් මීයන්ගේ දරුවන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවී සංසන්දනය කිරීම සඳහා අපි දිගු කලක් කියවා ඇති මෙටාජෙනොමික් අනුපිළිවෙල භාවිතා කළෙමු. පැටවුන්ට ඔවුන්ගේ මව්වරුන් මෙන් එකම ආහාර වේලක් ලබා දෙන ලදී. PPA-පොහොසත් ආහාර වේලක් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියේ සහ ක්ෂුද්‍රජීවී ක්‍රියාකාරී මාර්ගවල, විශේෂයෙන් PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සහ/හෝ PPA නිෂ්පාදනයට අදාළ වෙනස්කම් ඇති කරන බව අපි උපකල්පනය කළෙමු.
මෙම අධ්‍යයනයේදී මධ්‍යම ෆ්ලොරිඩා විශ්ව විද්‍යාලයේ ආයතනික සත්ව සත්කාර සහ භාවිත කමිටුවේ (UCF-IACUC) මාර්ගෝපදේශ අනුගමනය කරමින් ග්ලියා-විශේෂිත GFAP ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J සංක්‍රාන්ති මීයන් (ජැක්සන් රසායනාගාර) භාවිතා කරන ලදී (සත්ව භාවිත බලපත්‍ර අංකය: PROTO202000002). කිරි වැරීමෙන් පසු, මීයන් කූඩුවකට එක් එක් ලිංගයේ මීයන් 1–5 බැගින් කූඩුවල තනි තනිව තබා ඇත. පිරිසිදු කළ පාලන ආහාර වේලක් (වෙනස් කළ විවෘත ලේබල් සම්මත ආහාර වේලක්, 16 kcal% මේදය) හෝ සෝඩියම් ප්‍රොපියොනේට්-අතිරේක ආහාර වේලක් (වෙනස් කළ විවෘත ලේබල් සම්මත ආහාර වේලක්, 16 kcal% මේදය, 5,000 ppm සෝඩියම් ප්‍රොපියොනේට් අඩංගු) සමඟ මීයන්ට නිදහසේ පෝෂණය කරන ලදී. භාවිතා කරන ලද සෝඩියම් ප්‍රොපියොනේට් ප්‍රමාණය මුළු ආහාර බර 5,000 mg PFA/kg ට සමාන විය. ආහාර කල් තබා ගන්නා ද්‍රව්‍යයක් ලෙස භාවිතා කිරීම සඳහා අනුමත කරන ලද PPA හි ඉහළම සාන්ද්‍රණය මෙයයි. මෙම අධ්‍යයනය සඳහා සූදානම් වීම සඳහා, සංසර්ගයට සති 4 කට පෙර මව් මීයන්ට ආහාර දෙකම පෝෂණය කරන ලද අතර වේල්ලේ ගැබ් ගැනීම පුරාම එය දිගටම පැවතුනි. පැටවුන් මීයන් [මීයන් 22 ක්, පාලක 9 ක් (පිරිමි 6 ක්, ගැහැණු 3 ක්) සහ PPA 13 ක් (පිරිමි 4 ක්, ගැහැණු 9 ක්)] කිරි වැරූ අතර පසුව වේලි මෙන් මාස 5 ක් එකම ආහාර වේලෙහි දිගටම පැවතුනි. පැටවුන් මීයන් මාස 5 දී පූජා කරන ලද අතර ඔවුන්ගේ බඩවැල් මළපහ අන්තර්ගතයන් එකතු කර මුලින් -20°C දී මිලි ලීටර් 1.5 ක් ක්ෂුද්‍ර කේන්ද්‍රාපසාරී නලවල ගබඩා කර පසුව ධාරක DNA ක්ෂය වී ක්ෂුද්‍රජීවී න්‍යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණය කරන තෙක් -80°C ශීතකරණයකට මාරු කරන ලදී.
ධාරක DNA වෙනස් කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයකට අනුව ඉවත් කරන ලදී (Charalampous et al., 2019). කෙටියෙන් කිවහොත්, මළපහ අන්තර්ගතය 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) වෙත මාරු කර ශීත කළ ගබඩා කරන ලදී. එක් නිස්සාරණයකට උපරිම වශයෙන් මළපහ පෙති 1-2 ක් සකසන්න. ඉන්පසු මලපහ අන්තර්ගතය නළය තුළ ප්ලාස්ටික් පළිබෝධයක් භාවිතයෙන් යාන්ත්‍රිකව සමජාතීය කරන ලද අතර එමඟින් පොහොරක් සාදනු ලැබේ. සාම්පල විනාඩි 5 ක් හෝ සාම්පල පෙති බවට පත් වන තුරු 10,000 RCF හි කේන්ද්‍රාපසාරී කර, පසුව සුපිරි ද්‍රව්‍යය ආශ්වාස කර 250 µl 1× PBS හි පෙති නැවත පුරවන්න. යුකැරියෝටික් සෛල පටල ලිහිල් කිරීම සඳහා ඩිටර්ජන්ට් එකක් ලෙස සාම්පලයට 250 µl 4.4% සැපෝනින් ද්‍රාවණය (TCI, නිෂ්පාදන අංකය S0019) එක් කරන්න. සාම්පල සුමට වන තෙක් මෘදු ලෙස මිශ්‍ර කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 10 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. ඊළඟට, යුකැරියෝටික් සෛල කඩාකප්පල් කිරීම සඳහා, සාම්පලයට 350 μl නියුක්ලීස්-නිදහස් ජලය එකතු කරන ලද අතර, තත්පර 30 ක් සඳහා ඉන්කියුබේට් කරන ලද අතර, පසුව 12 μl 5 M NaCl එකතු කරන ලදී. ඉන්පසු සාම්පල 6000 RCF හි මිනිත්තු 5 ක් කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. සුපර්නේටන්ට් ආශ්වාස කර 100 μl 1X PBS හි පෙති නැවත සවි කරන්න. ධාරක DNA ඉවත් කිරීම සඳහා, 100 μl HL-SAN බෆරය (12.8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml නියුක්ලීස්-නිදහස් ජලය) සහ 10 μl HL-SAN එන්සයිම (ArticZymes P/N 70910-202) එකතු කරන ලදී. සාම්පල පයිප්ප ඇලවීමෙන් හොඳින් මිශ්‍ර කර Eppendorf™ ThermoMixer C මත 37 °C උෂ්ණත්වයකදී විනාඩි 30ක් 800 rpm උෂ්ණත්වයකදී ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු, 6000 RCF උෂ්ණත්වයකදී මිනිත්තු 3ක් කේන්ද්‍රාපසාරී කර 800 µl සහ 1000 µl 1X PBS සමඟ දෙවරක් සෝදා හරින ලදී. අවසානයේ, පෙල්ට් එක 100 µl 1X PBS තුළ නැවත සවි කරන්න.
නිව් එංගලන්ත බයෝලැබ්ස් මොනාක් ජෙනොමික් ඩීඑන්ඒ පිරිසිදු කිරීමේ කට්ටලය (නිව් එංගලන්ත බයෝලැබ්ස්, ඉප්ස්විච්, එම්ඒ, කැට්# T3010L) භාවිතයෙන් මුළු බැක්ටීරියා ඩීඑන්ඒ හුදකලා කරන ලදී. කට්ටලය සමඟ සපයා ඇති සම්මත මෙහෙයුම් ක්‍රියා පටිපාටිය තරමක් වෙනස් කර ඇත. අවසාන ඉවත් කිරීම සඳහා ක්‍රියාත්මක වීමට පෙර 60°C දී නියුක්ලීස්-නිදහස් ජලය ඉන්කියුබේට් කර නඩත්තු කරන්න. සෑම සාම්පලයකටම 10 µl ප්‍රෝටීනේස් K සහ 3 µl RNase A එකතු කරන්න. ඉන්පසු 100 µl සෛල ලයිසිස් බෆරයක් එකතු කර මෘදු ලෙස මිශ්‍ර කරන්න. ඉන්පසු සාම්පල 56°C සහ 1400 rpm දී අවම වශයෙන් පැය 1 ක් සහ පැය 3 ක් දක්වා එපෙන්ඩෝෆ්™ තාපමිශ්‍රක C තුළ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. ඉන්කියුබේට් කරන ලද සාම්පල 12,000 RCF හිදී මිනිත්තු 3 ක් සඳහා කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලද අතර සෑම සාම්පලයකින්ම සුපිරි ද්‍රව්‍යය බන්ධන ද්‍රාවණය 400 µL අඩංගු වෙනම 1.5 mL ක්ෂුද්‍ර කේන්ද්‍රාපසාරී නලයකට මාරු කරන ලදී. ඉන්පසු නල තත්පර 1 ක පරතරයකින් තත්පර 5-10 ක් ස්පන්දන සුළි සුළඟට ලක් කරන ලදී. එක් එක් සාම්පලයේ සම්පූර්ණ ද්‍රව අන්තර්ගතය (ආසන්න වශයෙන් 600–700 µL) ප්‍රවාහ-හරහා එකතු කිරීමේ නළයක තබා ඇති පෙරහන් කාට්රිජ් එකකට මාරු කරන්න. ආරම්භක DNA බන්ධනයට ඉඩ දීම සඳහා නල මිනිත්තු 3 ක් සඳහා 1,000 RCF හි කේන්ද්‍රාපසාරී කර, පසුව අවශේෂ ද්‍රව ඉවත් කිරීම සඳහා මිනිත්තු 1 ක් සඳහා 12,000 RCF හි කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. සාම්පල තීරුව නව එකතු කිරීමේ නළයකට මාරු කර පසුව දෙවරක් සෝදා ඇත. පළමු සේදීම සඳහා, සෑම නළයකටම 500 µL වොෂ් බෆරයක් එක් කරන්න. නළය 3-5 වතාවක් පෙරළා, පසුව විනාඩි 1 ක් 12,000 RCF හි කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න. එකතු කිරීමේ නළයෙන් ද්‍රවය ඉවතලන්න සහ පෙරහන් කාට්රිජ් නැවත එම එකතු කිරීමේ නළයටම තබන්න. දෙවන සේදීම සඳහා, පෙරහනට පෙරහනට 500 µL වොෂ් බෆරයක් එක් කරන්න. සාම්පල මිනිත්තු 1 ක් සඳහා 12,000 RCF හි කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. පෙරහන 1.5 mL LoBind® නලයකට මාරු කර පෙර රත් කළ නියුක්ලීස්-නිදහස් ජලය 100 µL එකතු කරන්න. පෙරහන් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 1 ක් පුර්ව ගන්වන ලද අතර පසුව මිනිත්තු 1 ක් සඳහා 12,000 RCF හි කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. එලූටඩ් DNA -80°C හි ගබඩා කරන ලදී.
Qubit™ 4.0 ෆ්ලෝරෝමීටරයක් ​​භාවිතයෙන් DNA සාන්ද්‍රණය ප්‍රමාණනය කරන ලදී. නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව Qubit™ 1X dsDNA අධි සංවේදීතා කට්ටලය (Cat. No. Q33231) භාවිතයෙන් DNA සකස් කරන ලදී. Aglient™ 4150 හෝ 4200 TapeStation භාවිතයෙන් DNA කොටස් දිග ව්‍යාප්තිය මනිනු ලැබීය. Agilent™ Genomic DNA Reagents (Cat. No. 5067-5366) සහ Genomic DNA ScreenTape (Cat. No. 5067-5365) භාවිතයෙන් DNA සකස් කරන ලදී. නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) භාවිතයෙන් පුස්තකාල සකස් කිරීම සිදු කරන ලදී. Min106D ප්‍රවාහ සෛලයක් (R 9.4.1) සහිත ONT GridION™ Mk1 අනුක්‍රමිකයක් භාවිතයෙන් DNA අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී. අනුක්‍රමික සැකසුම් වූයේ: ඉහළ නිරවද්‍යතා පාදක ඇමතුම, අවම q අගය 9, තීරු කේත සැකසුම සහ තීරු කේත කප්පාදුව. සාම්පල පැය 72 ක් සඳහා අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලද අතර, පසුව වැඩිදුර සැකසුම් සහ විශ්ලේෂණය සඳහා මූලික ඇමතුම් දත්ත ඉදිරිපත් කරන ලදී.
ජෛව තොරතුරු සැකසුම් කලින් විස්තර කරන ලද ක්‍රම භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී (ග්‍රීන්මන් සහ වෙනත් අය, 2024). අනුක්‍රමණයෙන් ලබාගත් FASTQ ගොනු එක් එක් නියැදිය සඳහා නාමාවලි වලට බෙදා ඇත. ජෛව තොරතුරු විශ්ලේෂණයට පෙර, දත්ත පහත නල මාර්ගය භාවිතයෙන් සකසන ලදී: පළමුව, සාම්පලවල FASTQ ගොනු තනි FASTQ ගොනුවකට ඒකාබද්ධ කරන ලදී. ඉන්පසු, 1000 bp ට වඩා අඩු කියවීම් Filtlong v. 0.2.1 භාවිතයෙන් පෙරහන් කරන ලද අතර, එකම පරාමිතිය වෙනස් කරන ලද්දේ –min_length 1000 (Wick, 2024) ය. තවදුරටත් පෙරීමට පෙර, පහත පරාමිතීන් සමඟ NanoPlot v. 1.41.3 භාවිතයෙන් කියවීමේ ගුණාත්මකභාවය පාලනය කරන ලදී: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster සහ Rademakers, 2023). පහත පරාමිතීන් සමඟ ධාරක-දූෂිත කියවීම් ඉවත් කිරීම සඳහා minimap2 v. 2.24-r1122 භාවිතයෙන් කියවීම් මූසික යොමු ජෙනෝමය GRCm39 (GCF_000001635.27) වෙත පෙළගස්වන ලදී: -L -ax map-ont(ලී, 2018). ජනනය කරන ලද පෙළගැස්වීමේ ගොනු samtools v. 1.16.1 හි samtools view -b (Danecek et al., 2021) භාවිතයෙන් BAM ආකෘතියට පරිවර්තනය කරන ලදී. පසුව samtools view -b -f 4 භාවිතයෙන් නොබැඳි කියවීම් හඳුනා ගන්නා ලදී, මෙම කියවීම් ධාරක ජෙනෝමයට අයත් නොවන බව පෙන්නුම් කරයි. පෙරනිමි පරාමිතීන් සමඟ samtools bam2fq භාවිතයෙන් නොබැඳි කියවීම් නැවත FASTQ ආකෘතියට පරිවර්තනය කරන ලදී. කලින් විස්තර කර ඇති සැකසුම් භාවිතයෙන් තවදුරටත් පෙරහන් කළ කියවීම් මත NanoPlot නැවත ධාවනය කරන ලදී. පෙරීමෙන් පසු, metaflye v. 2.8.2-b1689 භාවිතයෙන් metagenomic දත්ත එකලස් කරන ලදී: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). ඉතිරි පරාමිතීන් ඒවායේ පෙරනිමි අගයන්හි තබන්න. එකලස් කිරීමෙන් පසු, පෙරහන් කළ කියවීම් minimap2 භාවිතයෙන් එකලස් කිරීමට සිතියම්ගත කරන ලද අතර, -ax map-ont පරාමිතිය SAM ආකෘතියෙන් පෙළගැස්වීමේ ගොනුවක් ජනනය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. එකලස් කිරීම මුලින්ම racon v. 1.4.20 භාවිතයෙන් පහත පරාමිතීන් සමඟ පිරිපහදු කරන ලදී: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). racon සම්පූර්ණ කිරීමෙන් පසු, එය medaka_consesus භාවිතයෙන් medaka v. 1.7.2 සමඟ තවදුරටත් පිරිපහදු කරන ලදී, -m පරාමිතිය හැර අනෙකුත් සියලුම පරාමිතීන් ඒවායේ පෙරනිමි අගයන්හි ඉතිරිව ඇත. අපගේ දත්ත සඳහා භාවිතා කරන ප්‍රවාහ සෛල රසායන විද්‍යාව සහ ඉහළ නිරවද්‍යතා පාදක ඇමතුම් නියම කිරීම සඳහා -m පරාමිතිය r941_min_hac_g507 ලෙස සකසා ඇත (nanoporetech/medaka, 2024). පෙරහන් කරන ලද දත්ත (මින් ඉදිරියට ක්ෂුද්‍රජීවී දත්ත ලෙස හැඳින්වේ) සහ අවසාන පිරිසිදු කරන ලද එකලස් කිරීම පසුකාලීන විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
වර්ගීකරණ වර්ගීකරණය සඳහා, කියවීම් සහ එකලස් කරන ලද කොන්ටිග් Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) භාවිතයෙන් වර්ගීකරණය කරන ලදී. කියවීම් සහ එකලස් කිරීම් සඳහා පිළිවෙලින් වාර්තා සහ ප්‍රතිදාන ගොනු ජනනය කරන්න. කියවීම් සහ එකලස් කිරීම් විශ්ලේෂණය කිරීමට –use-names විකල්පය භාවිතා කරන්න. කියවීම් කොටස් සඳහා –gzip-සම්පීඩිත සහ –යුගලනය කරන ලද විකල්ප නිශ්චිතව දක්වා ඇත. මෙටජෙනෝම් වල ටැක්සා වල සාපේක්ෂ බහුලත්වය Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) භාවිතයෙන් ඇස්තමේන්තු කරන ලදී. අපි මුලින්ම පහත පරාමිතීන් සමඟ bracken-build භාවිතයෙන් පදනම් 1000 ක් අඩංගු kmer දත්ත සමුදායක් නිර්මාණය කළෙමු: -d-k 35 -l 1000 ගොඩනඟන ලද පසු, bracken kraken2 විසින් ජනනය කරන ලද වාර්තාව මත පදනම්ව ක්‍රියාත්මක වන අතර පහත විකල්ප භාවිතයෙන් දත්ත පෙරහන් කරයි: -d -I -O-p 1000 -එල්

ඒවා අතර, විශ්ලේෂණය කරනු ලබන වර්ගීකරණ මට්ටම අනුව P, G හෝ S තෝරා ගනු ලැබේ. ව්‍යාජ ධනාත්මක වර්ගීකරණයන්ගේ බලපෑම අවම කිරීම සඳහා, 1e-4 (1/10,000 කියවීම්) හි අවම සාපේක්ෂ බහුලතා සීමාවක් අනුගමනය කරන ලදී. සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණයට පෙර, බ්‍රැකන් (භාග_මුළු_කියවීම්) විසින් වාර්තා කරන ලද සාපේක්ෂ බහුලතා මධ්‍යගත ලොග්-අනුපාතය (CLR) පරිවර්තනය භාවිතයෙන් පරිවර්තනය කරන ලදී (Aitchison, 1982). CLR ක්‍රමය දත්ත පරිවර්තනය සඳහා තෝරා ගන්නා ලද්දේ එය පරිමාණ-වෙනස් නොවන සහ විරල නොවන දත්ත කට්ටල සඳහා ප්‍රමාණවත් බැවිනි (Gloor et al., 2017). CLR පරිවර්තනය ස්වභාවික ලඝුගණකය භාවිතා කරයි. බ්‍රැකන් විසින් වාර්තා කරන ලද ගණන් කිරීමේ දත්ත සාපේක්ෂ ලොග් ප්‍රකාශනය (RLE) භාවිතයෙන් සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී (Anders and Huber, 2010). matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 සහ අනුක්‍රමික ලඝුගණක (Gloor et al., 2017) සංයෝජනයක් භාවිතයෙන් සංඛ්‍යා ජනනය කරන ලදී. 0.12.2 සහ ස්ටැන්ටනොටේෂන් v. 0.5.0 (හන්ටර්, 2007; වස්කොම්, 2021; චාලියර් සහ වෙනත් අය, 2022). සාමාන්‍යකරණය කරන ලද බැක්ටීරියා ගණන් භාවිතා කරමින් එක් එක් සාම්පලය සඳහා බැසිලස්/බැක්ටීරොයිඩෙට්ස් අනුපාතය ගණනය කරන ලදී. වගු වල වාර්තා කර ඇති අගයන් දශම ස්ථාන 4 කට වට කර ඇත. ක්‍රැකන්ටූල්ස් v. 1.2 පැකේජයේ (Lu et al., 2022) සපයා ඇති alpha_diversity.py ස්ක්‍රිප්ට් භාවිතයෙන් සිම්ප්සන් විවිධත්ව දර්ශකය ගණනය කරන ලදී. බ්‍රැකන් වාර්තාව ස්ක්‍රිප්ට් එකේ සපයා ඇති අතර සිම්ප්සන් දර්ශකය "Si" -an පරාමිතිය සඳහා සපයා ඇත. බහුලත්වයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් මධ්‍යන්‍ය CLR වෙනස්කම් ≥ 1 හෝ ≤ -1 ලෙස අර්ථ දක්වා ඇත. ±1 ක මධ්‍යන්‍ය CLR වෙනසක් නියැදි වර්ගයක බහුලතාවයේ 2.7 ගුණයකින් වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කරයි. (+/-) ලකුණෙන් දැක්වෙන්නේ ටැක්සන් පිළිවෙලින් PPA සාම්පලයේ සහ පාලන සාම්පලයේ බහුලව තිබේද යන්නයි. මෑන්-විට්නි යූ පරීක්ෂණය (වර්ටනන් සහ වෙනත් අය, 2020) භාවිතයෙන් වැදගත්කම තීරණය කරන ලදී. සංඛ්‍යාලේඛන ආකෘති v. 0.14 (බෙන්ජමිනි සහ හොච්බර්ග්, 1995; සීබෝල්ඩ් සහ පර්ක්ටෝල්ඩ්, 2010) භාවිතා කරන ලද අතර, බහු පරීක්ෂණ සඳහා නිවැරදි කිරීම සඳහා බෙන්ජමනි-හොච්බර්ග් ක්‍රියා පටිපාටිය යොදන ලදී. සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම තීරණය කිරීම සඳහා එළිපත්ත ලෙස සකස් කරන ලද p-අගය ≤ 0.05 භාවිතා කරන ලදී.
ජාන විවරණ සහ සාපේක්ෂ බහුලතා ඇස්තමේන්තුව Maranga et al. (Maranga et al., 2023) විසින් විස්තර කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයේ වෙනස් කරන ලද අනුවාදයක් භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. පළමුව, SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016) භාවිතයෙන් සියලුම එකලස් කිරීම් වලින් 500 bp ට වඩා අඩු කොන්ටිග් ඉවත් කරන ලදී. තෝරාගත් එකලස් කිරීම් පසුව pan-metagenome එකකට ඒකාබද්ධ කරන ලදී. පහත පරාමිතීන් සහිත Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 හි සමාන්තර අනුවාදයක්) භාවිතයෙන් විවෘත කියවීමේ රාමු (ORFs) හඳුනා ගන්නා ලදී: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබුණු නියුක්ලියෝටයිඩ ගොනු පසුව Python භාවිතයෙන් පෙරහන් කර සියලුම අසම්පූර්ණ ජාන ඉවත් කරන ලදී. ඉන්පසු CD-HIT v. 4.8.1 පහත පරාමිතීන් සහිත ජාන පොකුරු කිරීමට භාවිතා කරන ලදී: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). ජනනය කරන ලද අතිරික්ත නොවන ජාන නාමාවලිය ජාන බහුලත්වය සහ විවරණ ඇස්තමේන්තු කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. සාපේක්ෂ ජාන බහුලත්වය KMA v. 1.4.9 භාවිතයෙන් ඇස්තමේන්තු කරන ලදී (ක්ලවුසන් et al., 2018). පළමුව, පහත පරාමිතීන් සහිත KMA දර්ශකය භාවිතයෙන් දර්ශක ගොනුවක් සාදන්න: -i -Oඉන්පසු, ජෛව තොරතුරු නල මාර්ග කොටසේ විස්තර කර ඇති පරිදි, එක් එක් සාම්පලය සඳහා ක්ෂුද්‍රජීවී කියවීම් සමඟ ජනනය කරන ලද දර්ශකය භාවිතා කරමින්, KMA පහත පරාමිතීන් සමඟ ක්‍රියාත්මක කරන ලදී: -i -O-ටී_ඩීබී-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. ඉන්පසුව, CLR භාවිතයෙන් ජාන ගණන සාමාන්‍යකරණය කරන ලද අතර, Sci-kit learn හි ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය (PCA) පන්තිය භාවිතා කරන ලදී (Pedregosa et al., 2011). පුරෝකථනය කරන ලද ජාන විවරණය eggNOG v. 2.1.12 හි emapper.py ස්ක්‍රිප්ට් සහ eggNOG දත්ත සමුදා අනුවාදය 5.0.2 භාවිතා කරමින් පහත පරාමිතීන් සමඟ අතිරික්ත නොවන ජාන නාමාවලිය මත සිදු කරන ලදී: –itype CDS –cpu 24 -i– දත්ත නාමාවලිය–go_evidence ඉලෙක්ට්‍රොනික නොවන – ප්‍රතිදානය– ප්‍රතිදාන නාමාවලිය–target_orthologs සියල්ල –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). ප්‍රමාණවත් සැකිලි ආවරණයක් සහ සැකිලි අනන්‍යතාවයක් (≥ 90%) සහ බහුලත්වය (ගැඹුර ≥ 3) සහිත ජාන තෝරා ගැනීම සඳහා KMA ප්‍රතිඵල පරීක්ෂා කරන ලදී. ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි CLR භාවිතයෙන් KMA ගැඹුරේ ප්‍රතිඵල පරිවර්තනය කරන ලදී. ඉන්පසු KMA ප්‍රතිඵල එක් එක් ජානය සඳහා කොන්ටිග් මූලාශ්‍රය භාවිතා කරමින් ක්‍රියාකාරී විවරණ සහ වර්ගීකරණ ප්‍රතිඵලවලින් කොන්ටිග් හැඳුනුම්පත් සමඟ සංසන්දනය කරන ලදී. ටැක්සා සමඟ මෙන්, ජාන බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් සාමාන්‍ය CLR වෙනසක් ≥ 1 හෝ ≤ -1 සහිත ජාන ලෙස අර්ථ දක්වා ඇති අතර, ජානය පිළිවෙලින් PPA හෝ පාලන සාම්පලවල බහුලව ඇති බව පෙන්නුම් කරන ලකුණක් (+/-) ඇත.
ජාන මාර්ග බහුලත්වය සංසන්දනය කිරීම සඳහා eggNOG විසින් පවරන ලද Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortholog (KO) හඳුනාගැනීම් අනුව ජාන මුලින්ම කාණ්ඩගත කරන ලදී. knockouts නොමැති ජාන හෝ බහු knockouts සහිත ජාන විශ්ලේෂණයට පෙර ඉවත් කරන ලදී. එක් එක් KO සාම්පලයක සාමාන්‍ය බහුලත්වය පසුව ගණනය කරන ලද අතර සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. KEGG_Pathway තීරුවේ ko00640 පේළියක් පවරා ඇති ඕනෑම ජානයක් ලෙස PPA පරිවෘත්තීය ජාන අර්ථ දක්වා ඇති අතර එය KEGG අනුව ප්‍රොපියොනේට් පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියේ භූමිකාවක් දක්වයි. PPA නිෂ්පාදනය හා සම්බන්ධ ලෙස හඳුනාගත් ජාන අතිරේක වගුව 1 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). PPA පරිවෘත්තීය සහ එක් එක් සාම්පල වර්ගය තුළ සැලකිය යුතු ලෙස බහුල වූ නිෂ්පාදන ජාන හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිසංස්කරණ පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී. විශ්ලේෂණය කරන ලද සෑම ජානයක් සඳහාම ප්‍රතිසංස්කරණ දහසක් සිදු කරන ලදී. සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම තීරණය කිරීම සඳහා 0.05 ක p-අගය කප්පාදුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. පොකුරක් තුළ ඇති නියෝජිත ජානවල සටහන් මත පදනම්ව, පොකුරක් තුළ ඇති තනි ජාන සඳහා ක්‍රියාකාරී සටහන් පවරන ලදී. PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය සහ/හෝ PPA නිෂ්පාදනය හා සම්බන්ධ ටැක්සා, ක්‍රැකන්2 ප්‍රතිදාන ගොනුවල ඇති කොන්ටිග් හැඳුනුම්පත්, eggNOG භාවිතයෙන් ක්‍රියාකාරී සටහන් කිරීමේදී රඳවා ගත් එකම කොන්ටිග් හැඳුනුම්පත් සමඟ ගැලපීමෙන් හඳුනාගත හැකිය. කලින් විස්තර කර ඇති මෑන්-විට්නි යූ පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් වැදගත්කම පරීක්ෂා කිරීම සිදු කරන ලදී. බෙන්ජමනි-හොච්බර්ග් ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතයෙන් බහු පරීක්ෂණ සඳහා නිවැරදි කිරීම සිදු කරන ලදී. සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම තීරණය කිරීම සඳහා ≤ 0.05 ක p-අගය කප්පාදුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.
සිම්ප්සන් විවිධත්ව දර්ශකය භාවිතයෙන් මීයන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ විවිධත්වය තක්සේරු කරන ලදී. ගණය සහ විශේෂ විවිධත්වය අනුව පාලන සහ PPA සාම්පල අතර සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්නට නොලැබුණි (ගණය සඳහා p-අගය: 0.18, විශේෂ සඳහා p-අගය: 0.16) (රූපය 1). ඉන්පසු ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය (PCA) භාවිතයෙන් ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතිය සංසන්දනය කරන ලදී. රූපය 2 මඟින් සාම්පල ඒවායේ ෆයිලා මගින් පොකුරු කිරීම පෙන්වන අතර, PPA සහ පාලන සාම්පල අතර ක්ෂුද්‍රජීවීන්ගේ විශේෂ සංයුතියේ වෙනස්කම් ඇති බව පෙන්නුම් කරයි. මෙම පොකුරු කිරීම ගණ මට්ටමින් අඩුවෙන් ප්‍රකාශ වූ අතර, PPA ඇතැම් බැක්ටීරියා වලට බලපාන බව යෝජනා කරයි (පරිපූරක රූපය 1).
රූපය 1. මීයන් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ ඇල්ෆා ගණ විවිධත්වය සහ විශේෂ සංයුතිය. PPA සහ පාලන සාම්පලවල ගණ (A) සහ විශේෂ (B) වල සිම්ප්සන් විවිධත්ව දර්ශක පෙන්වන කොටු බිම් කොටස්. මෑන්-විට්නි U පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් වැදගත්කම තීරණය කරන ලද අතර, බෙන්ජමනි-හොච්බර්ග් ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතයෙන් බහු නිවැරදි කිරීම් සිදු කරන ලදී. ns, p-අගය සැලකිය යුතු නොවීය (p>0.05).
රූපය 2. විශේෂ මට්ටමින් මූසික බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව සංයුතියේ ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵල. ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණ සැලැස්ම මඟින් ඒවායේ පළමු ප්‍රධාන සංරචක දෙක හරහා සාම්පල බෙදා හැරීම පෙන්වයි. වර්ණවලින් දැක්වෙන්නේ නියැදි වර්ගයයි: PPA- නිරාවරණය වූ මීයන් දම් පාට වන අතර පාලන මීයන් කහ වේ. ප්‍රධාන සංරචක 1 සහ 2 පිළිවෙලින් x-අක්ෂය සහ y-අක්ෂය මත සටහන් කර ඇති අතර ඒවායේ පැහැදිලි කරන ලද විචල්‍යතා අනුපාතය ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
RLE පරිවර්තනය කරන ලද ගණන් කිරීමේ දත්ත භාවිතා කරමින්, පාලන සහ PPA මීයන් තුළ මධ්‍ය බැක්ටීරොයිඩයිට්/බැසිලි අනුපාතයේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් නිරීක්ෂණය විය (පාලනය: 9.66, PPA: 3.02; p-අගය = 0.0011). මෙම වෙනසට හේතුව පාලක මීයන් හා සසඳන විට PPA මීයන් තුළ බැක්ටීරොයිඩයිට් බහුලත්වය වැඩි වීමයි, නමුත් වෙනස සැලකිය යුතු නොවීය (පාලන මධ්‍යන්‍ය CLR: 5.51, PPA මධ්‍යන්‍ය CLR: 6.62; p-අගය = 0.054), බැක්ටීරොයිඩයිට් බහුලත්වය සමාන විය (පාලන මධ්‍යන්‍ය CLR: 7.76, PPA මධ්‍යන්‍ය CLR: 7.60; p-අගය = 0.18).
බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ වර්ගීකරණ සාමාජිකයින්ගේ බහුලත්වය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් හෙළි වූයේ PPA සහ පාලන සාම්පල අතර 1 ෆයිලම් සහ විශේෂ 77 සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වූ බවයි (පරිපූරක වගුව 2). PPA සාම්පලවල විශේෂ 59 ක බහුලත්වය පාලන සාම්පලවලට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වූ අතර, පාලන සාම්පලවල විශේෂ 16 ක පමණක් බහුලත්වය PPA සාම්පලවලට වඩා වැඩි විය (රූපය 3).
රූපය 3. PPA සහ පාලන මීයන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ ටැක්සා වල අවකල බහුලත්වය. ගිනි කඳු බිම් කොටස් PPA සහ පාලන සාම්පල අතර ගණ (A) හෝ විශේෂ (B) බහුලතාවයේ වෙනස්කම් පෙන්වයි. අළු තිත් ටැක්සා බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනසක් පෙන්නුම් නොකරයි. වර්ණ තිත් බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් පෙන්නුම් කරයි (p-අගය ≤ 0.05). සාම්පල වර්ග අතර බහුලතාවයේ විශාලතම වෙනස්කම් ඇති ඉහළම ටැක්සා 20 පිළිවෙලින් රතු සහ ලා නිල් (පාලන සහ PPA සාම්පල) වලින් දක්වා ඇත. කහ සහ දම් පැහැති තිත් පාලන හෝ PPA සාම්පලවල පාලනවලට වඩා අවම වශයෙන් 2.7 ගුණයකින් බහුල විය. කළු තිත් සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් බහුලත්වයන් සහිත ටැක්සා නියෝජනය කරයි, මධ්‍යන්‍ය CLR -1 සහ 1 අතර වෙනස්කම් ඇත. P අගයන් මෑන්-විට්නි U පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද අතර බෙන්ජමනි-හොච්බර්ග් ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතයෙන් බහු පරීක්ෂණ සඳහා නිවැරදි කරන ලදී. තද මධ්‍යන්‍ය CLR වෙනස්කම් බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් පෙන්නුම් කරයි.
බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් පසුව, අපි ක්ෂුද්‍රජීවයේ ක්‍රියාකාරී විවරණයක් සිදු කළෙමු. අඩු ගුණාත්මක ජාන පෙරීමෙන් පසු, සියලුම සාම්පල හරහා අද්විතීය ජාන 378,355 ක් හඳුනා ගන්නා ලදී. මෙම ජානවල පරිවර්තනය වූ බහුලත්වය ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය (PCA) සඳහා භාවිතා කරන ලද අතර, ප්‍රතිඵල මගින් ඒවායේ ක්‍රියාකාරී පැතිකඩ මත පදනම්ව සාම්පල වර්ගවල ඉහළ මට්ටමේ පොකුරු කිරීමක් පෙන්නුම් කරන ලදී (රූපය 4).
රූපය 4. මූසික බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ ක්‍රියාකාරී පැතිකඩ භාවිතා කරමින් PCA ප්‍රතිඵල. PCA ප්‍රස්තාරය ඒවායේ පළමු ප්‍රධාන සංරචක දෙක හරහා සාම්පල බෙදා හැරීම පෙන්වයි. වර්ණවලින් දැක්වෙන්නේ නියැදි වර්ගයයි: PPA-නිරාවරණය වූ මීයන් දම් පාට වන අතර පාලන මීයන් කහ වේ. ප්‍රධාන සංරචක 1 සහ 2 පිළිවෙලින් x-අක්ෂය සහ y-අක්ෂය මත ප්‍රස්තාරය කර ඇති අතර ඒවායේ පැහැදිලි කරන ලද විචල්‍යතා අනුපාතය ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
ඊළඟට අපි විවිධ සාම්පල වර්ගවල KEGG knockouts බහුලත්වය පරීක්ෂා කළෙමු. අද්විතීය knockouts 3648 ක් හඳුනා ගන්නා ලද අතර, ඉන් 196 ක් පාලන සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස බහුල වූ අතර 106 ක් PPA සාම්පලවල බහුලව තිබුණි (රූපය 5). පාලන සාම්පලවල ජාන 145 ක් සහ PPA සාම්පලවල ජාන 61 ක් අනාවරණය වූ අතර, සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් බහුලත්වයක් තිබුණි. ලිපිඩ සහ ඇමයිනෝසීන පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට අදාළ මාර්ග PPA සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් විය (පරිපූරක වගුව 3). නයිට්‍රජන් පරිවෘත්තීය හා සල්ෆර් රිලේ පද්ධතිවලට අදාළ මාර්ග පාලන සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් විය (පරිපූරක වගුව 3). ඇමයිනෝසීන/නියුක්ලියෝටයිඩ පරිවෘත්තීය (ko:K21279) සහ ඉනොසිටෝල් පොස්පේට් පරිවෘත්තීය (ko:K07291) හා සම්බන්ධ ජානවල බහුලත්වය PPA සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 5). පාලන සාම්පලවල බෙන්සොයිට් පරිවෘත්තීය (ko:K22270), නයිට්‍රජන් පරිවෘත්තීය (ko:K00368) සහ ග්ලයිකොලිසිස්/ග්ලූකෝනියෝජෙනසිස් (ko:K00131) (රූපය 5) හා සම්බන්ධ ජාන සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය.
රූපය 5. PPA සහ පාලන මීයන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ KO වල අවකල බහුලත්වය. ගිනි කඳු කුමන්ත්‍රණය ක්‍රියාකාරී කණ්ඩායම් (KOs) බහුලතාවයේ වෙනස්කම් නිරූපණය කරයි. අළු තිත් මඟින් නියැදි වර්ග අතර බහුලත්වය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවූ KOs දක්වයි (p-අගය > 0.05). වර්ණ තිත් මඟින් බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (p-අගය ≤ 0.05). නියැදි වර්ග අතර බහුලතාවයේ විශාලතම වෙනස්කම් ඇති KOs 20 පිළිවෙලින් පාලන සහ PPA සාම්පලවලට අනුරූප වන රතු සහ ලා නිල් පැහැයෙන් දක්වා ඇත. කහ සහ දම් පැහැති තිත් මඟින් පාලනයේ සහ PPA සාම්පලවල අවම වශයෙන් 2.7 ගුණයකින් බහුල වූ KOs දක්වයි. කළු තිත් මඟින් සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් බහුලත්වයක් සහිත KOs පෙන්නුම් කරන අතර, -1 සහ 1 අතර මධ්‍යන්‍ය CLR වෙනස්කම් ඇත. P අගයන් මෑන්-විට්නි U පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද අතර බෙන්ජමනි-හොච්බර්ග් ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතයෙන් බහු සැසඳීම් සඳහා සකස් කරන ලදී. NaN මඟින් KO KEGG හි මාර්ගයකට අයත් නොවන බව පෙන්නුම් කරයි. තද මධ්‍යන්‍ය CLR වෙනස අගයන් බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි. ලැයිස්තුගත KOs අයත් වන මාර්ග පිළිබඳ සවිස්තරාත්මක තොරතුරු සඳහා, අතිරේක වගුව 3 බලන්න.
සටහන් කළ ජාන අතර, නියැදි වර්ග අතර ජාන 1601 ක් (p ≤ 0.05) සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් බහුලත්වයක් ඇති අතර, එක් එක් ජානය අවම වශයෙන් 2.7 ගුණයකින් බහුල විය. මෙම ජානවලින්, පාලන සාම්පලවල ජාන 4 ක් බහුලව දක්නට ලැබුණු අතර, PPA සාම්පලවල ජාන 1597 ක් බහුලව දක්නට ලැබුණි. PPA හි ක්ෂුද්‍ර ජීවී නාශක ගුණ ඇති බැවින්, සාම්පල වර්ග අතර PPA පරිවෘත්තීය හා නිෂ්පාදන ජානවල බහුලත්වය අපි පරීක්ෂා කළෙමු. PPA පරිවෘත්තීය ආශ්‍රිත ජාන 1332 අතර, පාලන සාම්පලවල ජාන 27 ක් සැලකිය යුතු ලෙස බහුල වූ අතර PPA සාම්පලවල ජාන 12 ක් බහුලව තිබුණි. PPA නිෂ්පාදන ආශ්‍රිත ජාන 223 අතර, PPA සාම්පලවල ජාන 1 ක් සැලකිය යුතු ලෙස බහුල විය. රූපය 6A තවදුරටත් පෙන්නුම් කරන්නේ PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ජානවල ඉහළ බහුලත්වය, පාලන සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ බහුලත්වය සහ විශාල බලපෑම් ප්‍රමාණයන් සමඟ, රූපය 6B PPA සාම්පලවල නිරීක්ෂණය කරන ලද සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ බහුලත්වයක් සහිත තනි ජාන ඉස්මතු කරන අතර.
රූපය 6. මූසික බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ PPA ආශ්‍රිත ජානවල අවකල බහුලත්වය. ගිනි කඳු බිම් කොටස් PPA පරිවෘත්තීය (A) සහ PPA නිෂ්පාදනය (B) සමඟ සම්බන්ධ ජානවල බහුලත්වයේ වෙනස්කම් නිරූපණය කරයි. අළු තිත් මඟින් සාම්පල වර්ග අතර බහුලත්වය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවූ ජාන දක්වයි (p-අගය > 0.05). වර්ණ තිත් බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (p-අගය ≤ 0.05). බහුලතාවයේ විශාලතම වෙනස්කම් ඇති ජාන 20 පිළිවෙලින් රතු සහ ලා නිල් (පාලනය සහ PPA සාම්පල) වලින් දක්වා ඇත. කහ සහ දම් පැහැති තිත් වල බහුලත්වය පාලන සාම්පලවලට වඩා පාලනයේ සහ PPA සාම්පලවල අවම වශයෙන් 2.7 ගුණයකින් වැඩි විය. කළු තිත් සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් බහුලත්වයක් සහිත ජාන නියෝජනය කරයි, මධ්‍යන්‍ය CLR -1 සහ 1 අතර වෙනස්කම් ඇත. P අගයන් මෑන්-විට්නි U පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද අතර බෙන්ජමිනි-හොච්බර්ග් ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතයෙන් බහු සැසඳීම් සඳහා නිවැරදි කරන ලදී. ජාන අතිරික්ත නොවන ජාන නාමාවලියෙහි නියෝජිත ජානවලට අනුරූප වේ. ජාන නාම KO ජානයක් දක්වන KEGG සංකේතයෙන් සමන්විත වේ. තද මධ්‍යන්‍ය CLR වෙනස්කම් සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් බහුලතා පෙන්නුම් කරයි. ඉරක් (-) පෙන්නුම් කරන්නේ KEGG දත්ත සමුදායේ ජානය සඳහා සංකේතයක් නොමැති බවයි.
PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සහ/හෝ නිෂ්පාදනයට අදාළ ජාන සහිත ටැක්සා හඳුනාගනු ලැබුවේ, කොන්ටිග් වල වර්ගීකරණ අනන්‍යතාවය ජානයේ කොන්ටිග් හැඳුනුම්පත සමඟ ගැලපීමෙනි. ගණ මට්ටමින්, ගණ 130 ක් PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට අදාළ ජාන ඇති බව සොයා ගන්නා ලද අතර ගණ 61 ක් PPA නිෂ්පාදනයට අදාළ ජාන ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (අතිරේක වගුව 4). කෙසේ වෙතත්, කිසිදු ගණයක් බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් පෙන්නුම් කළේ නැත (p > 0.05).
විශේෂ මට්ටමින්, බැක්ටීරියා විශේෂ 144 කට PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ජාන ඇති බව සොයා ගන්නා ලද අතර බැක්ටීරියා විශේෂ 68 කට PPA නිෂ්පාදනයට සම්බන්ධ ජාන ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (පරිපූරක වගුව 5). PPA පරිවෘත්තීයකාරක අතර, බැක්ටීරියා අටක් සාම්පල වර්ග අතර බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කළ අතර, සියල්ල බලපෑමේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් පෙන්නුම් කළේය (පරිපූරක වගුව 6). බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් සහිත සියලුම හඳුනාගත් PPA පරිවෘත්තීයකාරක PPA සාම්පලවල බහුලව දක්නට ලැබුණි. විශේෂ මට්ටමේ වර්ගීකරණය මගින් නියැදි වර්ග අතර සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවූ ගණවල නියෝජිතයින් අනාවරණය කරන ලදී, ඒවාට බැක්ටීරොයිඩ් සහ රුමිනොකොකස් විශේෂ කිහිපයක් මෙන්ම ඩන්කනියා ඩුබොයිස්, මයික්සොබැක්ටීරියම් එන්ටරිකා, මොනොකොකස් පෙක්ටිනොලයිටිකස් සහ ඇල්කලිජීනස් පොලිමෝර්ෆා ඇතුළත් වේ. PPA නිපදවන බැක්ටීරියා අතර, බැක්ටීරියා හතරක් සාම්පල වර්ග අතර බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් පෙන්නුම් කළේය. බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් ඇති විශේෂ අතර බැක්ටීරොයිඩ් නොවොරෝසි, ඩන්කනියා ඩුබොයිස්, මයික්සොබැක්ටීරියම් එන්ටරිටිඩිස් සහ රුමිනොකොකස් බොවිස් ඇතුළත් විය.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී, මීයන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයට PPA නිරාවරණයේ බලපෑම් අපි පරීක්ෂා කළෙමු. PPA බැක්ටීරියා තුළ විවිධ ප්‍රතිචාර ඇති කළ හැක්කේ එය ඇතැම් විශේෂ මගින් නිපදවන නිසා, වෙනත් විශේෂ විසින් ආහාර ප්‍රභවයක් ලෙස භාවිතා කරන නිසා හෝ ක්ෂුද්‍ර ජීවී බලපෑම් ඇති නිසා ය. එබැවින්, ආහාර අතිරේකය හරහා එය බඩවැල් පරිසරයට එකතු කිරීම ඉවසීම, සංවේදීතාව සහ පෝෂක ප්‍රභවයක් ලෙස එය භාවිතා කිරීමේ හැකියාව මත පදනම්ව වෙනස් බලපෑම් ඇති කළ හැකිය. සංවේදී බැක්ටීරියා විශේෂ ඉවත් කර PPA වලට වඩා ප්‍රතිරෝධී හෝ ආහාර ප්‍රභවයක් ලෙස එය භාවිතා කිරීමට හැකි ඒවා මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය කළ හැකි අතර, එමඟින් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ සංයුතියේ වෙනස්කම් ඇති වේ. අපගේ ප්‍රතිඵල මගින් ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය වූ නමුත් සමස්ත ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වයට කිසිදු බලපෑමක් නැත. විශාලතම බලපෑම් විශේෂ මට්ටමින් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, PPA සහ පාලන සාම්පල අතර බහුලත්වයෙන් ටැක්සා 70 කට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වේ (පරිපූරක වගුව 2). PPA-නිරාවරණය වූ සාම්පලවල සංයුතිය තවදුරටත් ඇගයීමෙන් හෙළි වූයේ නිරාවරණය නොවූ සාම්පලවලට සාපේක්ෂව ක්ෂුද්‍ර ජීවී විශේෂවල වැඩි විෂමතාවයක් PPA මගින් බැක්ටීරියා වර්ධන ලක්ෂණ වැඩි දියුණු කළ හැකි බවත් PPA-පොහොසත් පරිසරවල ජීවත් විය හැකි බැක්ටීරියා ජනගහනය සීමා කළ හැකි බවත්ය. මේ අනුව, PPA මගින් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව විවිධත්වය පුළුල් ලෙස කඩාකප්පල් කිරීමට වඩා තෝරා බේරා වෙනස්කම් ඇති කළ හැකිය.
PPA වැනි ආහාර කල් තබා ගන්නා ද්‍රව්‍ය සමස්ත විවිධත්වයට බලපෑම් නොකර බඩවැල් ක්ෂුද්‍ර ජීවී සංරචකවල බහුලත්වය වෙනස් කරන බව මීට පෙර පෙන්වා දී ඇත (Nagpal et al., 2021). මෙහිදී, PPA-නිරාවරණය වූ මීයන් තුළ සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලද Bacteroidetes (පෙර Bacteroidetes ලෙස හැඳින්වූ) කාණ්ඩය තුළ ඇති Bacteroidetes විශේෂ අතර වඩාත්ම කැපී පෙනෙන වෙනස්කම් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. Bacteroides විශේෂවල බහුලත්වය වැඩි වීම ශ්ලේෂ්මල පිරිහීම වැඩි වීම සමඟ සම්බන්ධ වේ, එය ආසාදන අවදානම වැඩි කළ හැකි අතර දැවිල්ල ප්‍රවර්ධනය කළ හැකිය (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Bacteroides fragilis සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අලුත උපන් පිරිමි මීයන් ඔටිසම් වර්ණාවලී ආබාධය (ASD) සිහිපත් කරන සමාජ හැසිරීම් ප්‍රදර්ශනය කළ බව එක් අධ්‍යයනයකින් හෙළි වූ අතර (Carmel et al., 2023), සහ අනෙකුත් අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ Bacteroides විශේෂවලට ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය වෙනස් කළ හැකි අතර ස්වයං ප්‍රතිශක්තිකරණ ගිනි අවුලුවන හෘද රෝග ඇති කළ හැකි බවයි (Gil-Cruz et al., 2019). PPA වලට නිරාවරණය වූ මීයන් තුළ Ruminococcus, Prevotella සහ Parabacteroides ගණයට අයත් විශේෂ ද සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (Coretti et al., 2018). ඇතැම් Ruminococcus විශේෂ ප්‍රෝඉන්ෆ්ලමේටරි සයිටොකයින් නිෂ්පාදනය හරහා ක්‍රෝන්ගේ රෝගය වැනි රෝග සමඟ සම්බන්ධ වේ (Henke et al., 2019), Prevotella humani වැනි Prevotella විශේෂ අධි රුධිර පීඩනය සහ ඉන්සියුලින් සංවේදීතාව වැනි පරිවෘත්තීය රෝග සමඟ සම්බන්ධ වේ (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). අවසාන වශයෙන්, Bacteroidetes විශේෂවල ඉහළ සමස්ත බහුලත්වය හේතුවෙන්, PPA-නිරාවරණය වූ මීයන් තුළ Bacteroidetes (පෙර Firmicutes ලෙස හැඳින්විණි) අනුපාතය පාලන මීයන්ට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස අඩු බව අපට පෙනී ගියේය. මෙම අනුපාතය බඩවැල් හෝමියස්ටැසිස් පිළිබඳ වැදගත් දර්ශකයක් ලෙස මීට පෙර පෙන්වා දී ඇති අතර, මෙම අනුපාතයේ කැළඹීම් විවිධ රෝග තත්වයන් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇත (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), ගිනි අවුලුවන බඩවැල් රෝග ඇතුළුව (Stojanov et al., 2020). සාමූහිකව, බැක්ටීරොයිඩෙට්ස් කාණ්ඩයේ විශේෂයන් ආහාරමය PPA ඉහළ යාමෙන් වඩාත් ප්‍රබල ලෙස බලපාන බව පෙනේ. මෙය PPA වලට ඉහළ ඉවසීමක් හෝ PPA බලශක්ති ප්‍රභවයක් ලෙස භාවිතා කිරීමේ හැකියාව නිසා විය හැකිය, එය අවම වශයෙන් එක් විශේෂයක් සඳහා සත්‍ය බව පෙන්වා දී ඇත, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). විකල්පයක් ලෙස, මාතෘ PPA නිරාවරණය මීයන්ගේ පැටවුන්ගේ බඩවැල් බැක්ටීරොයිඩෙට්ස් ජනපදකරණයට වඩාත් ගොදුරු විය හැකි බවට පත් කිරීමෙන් භ්‍රෑණ වර්ධනය වැඩි දියුණු කළ හැකිය; කෙසේ වෙතත්, අපගේ අධ්‍යයන සැලසුම එවැනි තක්සේරුවකට ඉඩ දුන්නේ නැත.
මෙටජෙනොමික් අන්තර්ගත තක්සේරුව මගින් PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය හා නිෂ්පාදනය හා සම්බන්ධ ජානවල බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය වූ අතර, PPA-නිරාවරණය වූ මීයන් PPA නිෂ්පාදනය සඳහා වගකිව යුතු ජානවල ඉහළ බහුලත්වයක් පෙන්නුම් කළ අතර, PPA-නිරාවරණය නොවූ මීයන් PAA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට වගකිව යුතු ජානවල ඉහළ බහුලත්වයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 6). මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියට PPA හි බලපෑම එහි භාවිතය නිසා පමණක් නොවිය හැකි බවත්, එසේ නොමැතිනම් PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ජානවල බහුලත්වය PPA-නිරාවරණය වූ මීයන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ ඉහළ බහුලත්වයක් පෙන්නුම් කළ යුතු බවත්ය. එක් පැහැදිලි කිරීමක් නම්, PPA බැක්ටීරියා බහුලත්වය මැදිහත් වන්නේ ප්‍රධාන වශයෙන් බැක්ටීරියා පෝෂ්‍ය පදාර්ථයක් ලෙස භාවිතා කිරීමෙන් නොව එහි ප්‍රති-ක්ෂුද්‍රජීවී බලපෑම් හරහා බවයි. PPA මාත්‍රාව මත යැපෙන ආකාරයකින් සැල්මොනෙල්ලා ටයිෆිමියුරියම් වර්ධනය වළක්වන බව පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත (ජේකොබ්සන් සහ වෙනත් අය, 2018). PPA හි ඉහළ සාන්ද්‍රණයකට නිරාවරණය වීමෙන් එහි ප්‍රති-ක්ෂුද්‍රජීවී ගුණාංගවලට ප්‍රතිරෝධී වන බැක්ටීරියා සඳහා තෝරා ගත හැකි අතර එය පරිවෘත්තීය කිරීමට හෝ නිෂ්පාදනය කිරීමට නොහැකි විය හැකිය. උදාහරණයක් ලෙස, පැරබැක්ටීරොයිඩ් විශේෂ කිහිපයක් PPA සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ බහුලත්වයක් පෙන්නුම් කළ නමුත් PPA පරිවෘත්තීය හෝ නිෂ්පාදනයට අදාළ කිසිදු ජානයක් අනාවරණය නොවීය (අතිරේක වගු 2, 4 සහ 5). තවද, පැසවීම අතුරු නිෂ්පාදනයක් ලෙස PPA නිෂ්පාදනය විවිධ බැක්ටීරියා අතර බහුලව බෙදා හරිනු ලැබේ (Gonzalez-Garcia et al., 2017). පාලන සාම්පලවල PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට අදාළ ජානවල ඉහළ බහුලතාවයට හේතුව ඉහළ බැක්ටීරියා විවිධත්වයක් විය හැකිය (Averina et al., 2020). තවද, ජාන 1332 න් 27 (2.14%) ක් පමණක් PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට පමණක් සම්බන්ධ ජාන බවට පුරෝකථනය කර ඇත. PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ බොහෝ ජාන වෙනත් පරිවෘත්තීය මාර්ගවල ද සම්බන්ධ වේ. මෙය තවදුරටත් පෙන්නුම් කරන්නේ PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ජානවල බහුලත්වය පාලන සාම්පලවල වැඩි බවයි; මෙම ජාන PPA භාවිතයට හෝ අතුරු නිෂ්පාදනයක් ලෙස ගොඩනැගීමට හේතු නොවන මාර්ගවල ක්‍රියා කළ හැකිය. මෙම අවස්ථාවේදී, PPA උත්පාදනය හා සම්බන්ධ එක් ජානයක් පමණක් සාම්පල වර්ග අතර බහුලතාවයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් පෙන්නුම් කළේය. PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ජානවලට ප්‍රතිවිරුද්ධව, PPA නිෂ්පාදනය සඳහා සලකුණු ජාන තෝරා ගනු ලැබුවේ ඒවා PPA නිෂ්පාදනය සඳහා බැක්ටීරියා මාර්ගයට සෘජුවම සම්බන්ධ වන බැවිනි. PPA-නිරාවරණය වූ මීයන් තුළ, සියලුම විශේෂවලට PPA නිපදවීමේ බහුලත්වය සහ ධාරිතාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වී ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී. PPAs විසින් PPA නිෂ්පාදකයින් තෝරා ගනු ඇති බවට වන අනාවැකියට මෙය සහාය වන අතර එම නිසා PPA නිෂ්පාදන ධාරිතාව වැඩි වනු ඇතැයි පුරෝකථනය කරයි. කෙසේ වෙතත්, ජාන බහුලත්වය අනිවාර්යයෙන්ම ජාන ප්‍රකාශනය සමඟ සහසම්බන්ධ නොවේ; මේ අනුව, පාලන සාම්පලවල PPA පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ ජාන බහුලත්වය වැඩි වුවද, ප්‍රකාශන අනුපාතය වෙනස් විය හැකිය (Shi et al., 2014). PPA නිපදවන ජානවල ව්‍යාප්තිය සහ PPA නිෂ්පාදනය අතර සම්බන්ධතාවය තහවුරු කිරීම සඳහා, PPA නිෂ්පාදනයට සම්බන්ධ ජානවල ප්‍රකාශනය පිළිබඳ අධ්‍යයනයන් අවශ්‍ය වේ.
PPA සහ පාලන මෙටාජෙනෝමවල ක්‍රියාකාරී විවරණය මඟින් යම් වෙනස්කම් අනාවරණය විය. ජාන අන්තර්ගතය පිළිබඳ PCA විශ්ලේෂණය PPA සහ පාලන සාම්පල අතර විවික්ත පොකුරු අනාවරණය විය (රූපය 5). නියැදි පොකුරුකරණයෙන් හෙළි වූයේ පාලන ජාන අන්තර්ගතය වඩාත් විවිධාකාර වූ අතර PPA සාම්පල එකට පොකුරු කර ඇති බවයි. ජාන අන්තර්ගතය අනුව පොකුරු කිරීම විශේෂ සංයුතිය අනුව පොකුරු කිරීම හා සැසඳිය හැකිය. මේ අනුව, මාර්ග බහුලතාවයේ වෙනස්කම් ඒවා තුළ නිශ්චිත විශේෂ සහ වික්‍රියා වල බහුලත්වයේ වෙනස්කම් සමඟ අනුකූල වේ. PPA සාම්පලවල, සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි බහුලතාවයක් ඇති මාර්ග දෙකක් ඇමයිනෝසීන/නියුක්ලියෝටයිඩ සීනි පරිවෘත්තීය (ko:K21279) සහ බහු ලිපිඩ පරිවෘත්තීය මාර්ග (ko:K00647, ko:K03801; අතිරේක වගුව 3) සමඟ සම්බන්ධ විය. ko:K21279 සමඟ සම්බන්ධ ජාන PPA සාම්පලවල සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විශේෂ සංඛ්‍යාවක් ඇති ජනකවලින් එකක් වන බැක්ටීරොයිඩ් ගණයට සම්බන්ධ බව දන්නා කරුණකි. මෙම එන්සයිමයට කැප්සියුලර් පොලිසැකරයිඩ ප්‍රකාශ කිරීමෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරය මග හැරිය හැක (Wang et al., 2008). PPA වලට නිරාවරණය වූ මීයන් තුළ නිරීක්ෂණය කරන ලද බැක්ටීරොයිඩයිට් වැඩිවීමට මෙය හේතු විය හැක. මෙය PPA ක්ෂුද්‍රජීවයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද වැඩි වූ මේද අම්ල සංස්ලේෂණයට අනුපූරක වේ. බැක්ටීරියා මේද අම්ල නිපදවීමට FASIIko:K00647 (fabB) මාර්ගය භාවිතා කරයි, එය ධාරක පරිවෘත්තීය මාර්ගවලට බලපෑම් කළ හැකිය (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), සහ ලිපිඩ පරිවෘත්තීය වෙනස්වීම් ස්නායු සංවර්ධනයට භූමිකාවක් ඉටු කළ හැකිය (Yu et al., 2020). PPA සාම්පලවල වැඩි වූ බහුලත්වය පෙන්නුම් කරන තවත් මාර්ගයක් වූයේ ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන ජෛව සංස්ලේෂණයයි (ko:K12343). බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයට හෝමෝන මට්ටම්වලට බලපෑම් කිරීමට සහ හෝමෝන මගින් බලපෑම් කිරීමට ඇති හැකියාව අතර ප්‍රතිලෝම සම්බන්ධතාවයක් ඇති බවට සාක්ෂි වර්ධනය වෙමින් පවතී, එනම් ඉහළ ස්ටෙරොයිඩ් මට්ටම් පහළ සෞඛ්‍ය ප්‍රතිවිපාක ඇති කළ හැකිය (Tetel et al., 2018).
මෙම අධ්‍යයනයට සීමාවන් සහ සලකා බැලීම් නොමැත. වැදගත් වෙනසක් නම්, අපි සතුන්ගේ භෞතික විද්‍යාත්මක තක්සේරු කිරීම් සිදු නොකිරීමයි. එබැවින්, ක්ෂුද්‍රජීවයේ වෙනස්කම් කිසියම් රෝගයක් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇත්දැයි සෘජුවම නිගමනය කළ නොහැක. තවත් කරුණක් නම්, මෙම අධ්‍යයනයේ මීයන්ට ඔවුන්ගේ මව්වරුන්ට ලබා දුන් ආහාර වේලම ලබා දීමයි. PPA-පොහොසත් ආහාර වේලකින් PPA-නිදහස් ආහාර වේලකට මාරු වීම ක්ෂුද්‍රජීවයට එහි බලපෑම් වැඩි දියුණු කරයිද යන්න අනාගත අධ්‍යයනයන් තීරණය කළ හැකිය. අපගේ අධ්‍යයනයේ එක් සීමාවක්, අනෙක් බොහෝ අය මෙන්, සීමිත සාම්පල ප්‍රමාණයයි. වලංගු නිගමනවලට එළඹිය හැකි වුවද, විශාල සාම්පල ප්‍රමාණය ප්‍රතිඵල විශ්ලේෂණය කිරීමේදී වැඩි සංඛ්‍යානමය බලයක් ලබා දෙනු ඇත. බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ වෙනස්කම් සහ ඕනෑම රෝගයක් අතර සම්බන්ධයක් පිළිබඳ නිගමනවලට එළඹීම ගැන ද අපි ප්‍රවේශම් වෙමු (Yap et al., 2021). වයස, ස්ත්‍රී පුරුෂ භාවය සහ ආහාර වේල ඇතුළු ව්‍යාකූල සාධක ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගේ සංයුතියට සැලකිය යුතු ලෙස බලපෑ හැකිය. සංකීර්ණ රෝග සමඟ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ සම්බන්ධය සම්බන්ධයෙන් සාහිත්‍යයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද නොගැලපීම් මෙම සාධක මගින් පැහැදිලි කළ හැකිය (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). උදාහරණයක් ලෙස, ASD ඇති සතුන් සහ මිනිසුන් තුළ Bacteroidetes ගණයේ සාමාජිකයින් වැඩි වී හෝ අඩු වී ඇති බව පෙන්වා දී ඇත (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). ඒ හා සමානව, ගිනි අවුලුවන බඩවැල් රෝග ඇති රෝගීන්ගේ බඩවැල් සංයුතිය පිළිබඳ අධ්‍යයනයන් මගින් එකම ටැක්සාවේ වැඩිවීම සහ අඩුවීම යන දෙකම සොයාගෙන ඇත (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). ස්ත්‍රී පුරුෂ භාවයේ පක්ෂග්‍රාහී බලපෑම සීමා කිරීම සඳහා, අපි ස්ත්‍රී පුරුෂ භාවයේ සමාන නියෝජනය සහතික කිරීමට උත්සාහ කළෙමු, එවිට වෙනස්කම් බොහෝ විට ආහාර වේල මගින් මෙහෙයවනු ලැබේ. ක්‍රියාකාරී විවරණයේ එක් අභියෝගයක් වන්නේ අතිරික්ත ජාන අනුපිළිවෙල ඉවත් කිරීමයි. අපගේ ජාන පොකුරු ක්‍රමයට 95% අනුක්‍රමික අනන්‍යතාවයක් සහ 85% දිග සමානතාවයක් මෙන්ම ව්‍යාජ පොකුරු ඉවත් කිරීම සඳහා 90% පෙළගැස්වීමේ ආවරණයක් අවශ්‍ය වේ. කෙසේ වෙතත්, සමහර අවස්ථාවලදී, අපි එකම විවරණ සහිත COGs නිරීක්ෂණය කළෙමු (උදා: MUT) (රූපය 6). මෙම ඕතොලොජිස්ට්වරුන් වෙනස්ද, නිශ්චිත ජනක සමඟ සම්බන්ධද, නැතහොත් මෙය ජාන පොකුරු ප්‍රවේශයේ සීමාවක්ද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් අවශ්‍ය වේ. ක්‍රියාකාරී විවරණයේ තවත් සීමාවක් වන්නේ විභව වැරදි වර්ගීකරණයයි; බැක්ටීරියා ජානය mmdA යනු ප්‍රොපියොනේට් සංස්ලේෂණයට සම්බන්ධ දන්නා එන්සයිමයකි, නමුත් KEGG එය ප්‍රොපියොනේට් පරිවෘත්තීය මාර්ගය සමඟ සම්බන්ධ නොකරයි. ඊට වෙනස්ව, scpB සහ mmcD ඕතොලොජිස්ට්වරුන් සම්බන්ධ වේ. නම් කරන ලද නොක්අවුට් නොමැති ජාන විශාල සංඛ්‍යාවක් ජාන බහුලත්වය තක්සේරු කිරීමේදී PPA-ආශ්‍රිත ජාන හඳුනා ගැනීමට නොහැකි වීමට හේතු විය හැක. අනාගත අධ්‍යයනයන් මගින් මෙටාට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටෝම් විශ්ලේෂණයෙන් ප්‍රතිලාභ ලැබෙනු ඇත, එමඟින් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ ක්‍රියාකාරී ලක්ෂණ පිළිබඳ ගැඹුරු අවබෝධයක් ලබා දිය හැකි අතර විභව පහළ බලපෑම් සමඟ ජාන ප්‍රකාශනය සම්බන්ධ කළ හැකිය. නිශ්චිත ස්නායු සංවර්ධන ආබාධ හෝ ගිනි අවුලුවන බඩවැල් රෝග සම්බන්ධ අධ්‍යයනයන් සඳහා, ක්ෂුද්‍රජීව සංයුතියේ වෙනස්කම් මෙම ආබාධවලට සම්බන්ධ කිරීම සඳහා සතුන්ගේ භෞතික විද්‍යාත්මක සහ හැසිරීම් තක්සේරු කිරීම් අවශ්‍ය වේ. ක්ෂුද්‍රජීවකය විෂබීජ රහිත මීයන් තුළට බද්ධ කිරීම පිළිබඳ අතිරේක අධ්‍යයනයන් ද ක්ෂුද්‍රජීවකය රෝගයේ ධාවකයක්ද නැතහොත් ලක්ෂණයක්ද යන්න තීරණය කිරීමට ප්‍රයෝජනවත් වනු ඇත.
සාරාංශයක් ලෙස, ආහාරමය PPA, බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ සංයුතිය වෙනස් කිරීමේ සාධකයක් ලෙස ක්‍රියා කරන බව අපි පෙන්නුම් කළෙමු. PPA යනු විවිධ ආහාරවල බහුලව දක්නට ලැබෙන FDA-අනුමත කල් තබා ගන්නා ද්‍රව්‍යයක් වන අතර එය දිගු කාලීනව නිරාවරණය වීමෙන් සාමාන්‍ය බඩවැල් වෘක්ෂලතාදිය කඩාකප්පල් කිරීමට හේතු විය හැක. බැක්ටීරියා කිහිපයක බහුලතාවයේ වෙනස්කම් අපට හමු වූ අතර, එයින් ඇඟවෙන්නේ PPA බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ සංයුතියට බලපෑම් කළ හැකි බවයි. ක්ෂුද්‍රජීවයේ වෙනස්කම් ඇතැම් පරිවෘත්තීය මාර්ගවල මට්ටම්වල වෙනස්කම් වලට හේතු විය හැකි අතර එමඟින් සත්කාරක සෞඛ්‍යයට අදාළ භෞතික විද්‍යාත්මක වෙනස්කම් ඇති විය හැකිය. ආහාරමය PPA ක්ෂුද්‍රජීවී සංයුතියට ඇති කරන බලපෑම් ඩිස්බියෝසිස් හෝ වෙනත් රෝග වලට හේතු විය හැකිද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් අවශ්‍ය වේ. මෙම අධ්‍යයනය බඩවැල් සංයුතියට PPA බලපෑම් මිනිස් සෞඛ්‍යයට බලපාන ආකාරය පිළිබඳ අනාගත අධ්‍යයනයන් සඳහා අඩිතාලම දමයි.
මෙම අධ්‍යයනයේ ඉදිරිපත් කර ඇති දත්ත කට්ටල මාර්ගගත ගබඩාවල ඇත. ගබඩා නාමය සහ ප්‍රවේශ අංකය: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
මෙම සත්ව අධ්‍යයනය මධ්‍යම ෆ්ලොරිඩා විශ්ව විද්‍යාලයේ ආයතනික සත්ව සත්කාර සහ භාවිත කමිටුව (UCF-IACUC) විසින් අනුමත කරන ලදී (සත්ව භාවිත බලපත්‍ර අංකය: PROTO202000002). මෙම අධ්‍යයනය දේශීය නීති, රෙගුලාසි සහ ආයතනික අවශ්‍යතාවලට අනුකූල වේ.
NG: සංකල්පීයකරණය, දත්ත සැකසීම, විධිමත් විශ්ලේෂණය, විමර්ශනය, ක්‍රමවේදය, මෘදුකාංග, දෘශ්‍යකරණය, ලිවීම (මුල් කෙටුම්පත), ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය). LA: සංකල්පීයකරණය, දත්ත සැකසීම, ක්‍රමවේදය, සම්පත්, ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය). SH: විධිමත් විශ්ලේෂණය, මෘදුකාංග, ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය). SA: විමර්ශනය, ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය). ප්‍රධාන විනිසුරු: විමර්ශනය, ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය). SN: සංකල්පීයකරණය, ව්‍යාපෘති පරිපාලනය, සම්පත්, අධීක්ෂණය, ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය). TA: සංකල්පීයකරණය, ව්‍යාපෘති පරිපාලනය, අධීක්ෂණය, ලිවීම (සමාලෝචනය සහ සංස්කරණය).
මෙම ලිපියේ පර්යේෂණ, කර්තෘත්වය සහ/හෝ ප්‍රකාශනය සඳහා කිසිදු මූල්‍ය ආධාරයක් නොලැබුණු බව කතුවරුන් ප්‍රකාශ කළහ.
උනන්දුව පිළිබඳ ගැටුමක් ලෙස අර්ථ දැක්විය හැකි කිසිදු වාණිජ හෝ මූල්‍ය සම්බන්ධතාවක් නොමැති අවස්ථාවක පර්යේෂණය සිදු කරන ලද බව කතුවරුන් ප්‍රකාශ කරයි. අදාළ නොවේ.
මෙම ලිපියේ ප්‍රකාශිත සියලුම අදහස් තනිකරම කතුවරුන්ගේ අදහස් වන අතර ඒවායේ ආයතන, ප්‍රකාශකයින්ගේ, සංස්කාරකවරුන්ගේ හෝ සමාලෝචකයින්ගේ අදහස් අනිවාර්යයෙන්ම පිළිබිඹු නොකරයි. මෙම ලිපියෙන් ඇගයීමට ලක් කරන ලද ඕනෑම නිෂ්පාදනයක් හෝ ඒවායේ නිෂ්පාදකයින් විසින් කරන ලද ඕනෑම හිමිකම් පෑමක් ප්‍රකාශකයා විසින් සහතික කර හෝ අනුමත කර නොමැත.
මෙම ලිපිය සඳහා අතිරේක ද්‍රව්‍ය මාර්ගගතව සොයාගත හැකිය: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
අබ්ඩෙලි එල්එස්, සැම්සම් ඒ, නසාර් එස්ඒ (2019). ප්‍රොපියොනික් අම්ලය ඔටිසම් වර්ණාවලී ආබාධවලදී PTEN/AKT මාර්ගය නියාමනය කිරීමෙන් ග්ලියෝසිස් සහ ස්නායු දැවිල්ල ඇති කරයි. විද්‍යාත්මක වාර්තා 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
අයිචිසන්, ජේ. (1982). සංයුති දත්තවල සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය. ජේආර් ස්ටැට් සොක් සර් බී මෙතඩොල්. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
අහ්න් ජේ, ක්වොන් එච්, කිම් වයිජේ (2023). පියයුරු පිළිකා සඳහා අවදානම් සාධකයක් ලෙස ස්ථිරකාරක/බැක්ටීරියායිඩ් අනුපාතය. සායනික වෛද්‍ය සඟරාව, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
ඇන්ඩර්ස් එස්., හියුබර් ඩබ්ලිව්. (2010). අනුක්‍රමික ගණන් දත්තවල අවකල ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
ඇන්ජලිස්, එම්ඩී, පිකෝලෝ, එම්., වන්නිනි, එල්., සිරගුසා, එස්., ජියාකොමෝ, ඒඩී, සෙරාසැනෙට්ටි, ඩීඅයි, සහ තවත් අය (2013). ඔටිසම් සහ ව්‍යාප්ත සංවර්ධන ආබාධ සහිත දරුවන්ගේ මළ මූත්‍රා සහ පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය වෙනත් ආකාරයකින් නිශ්චිතව දක්වා නොමැත. PLoS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). ඔටිසම් වර්ණාවලී ආබාධ සහිත කුඩා දරුවන්ගේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ බැක්ටීරියා ස්නායු පරිවෘත්තීය ලක්ෂණ. වෛද්‍ය ක්ෂුද්‍රජීව විද්‍යාව පිළිබඳ සඟරාව 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). මිනිස් අවයවයක් ලෙස ක්ෂුද්‍රජීවය. සායනික ක්ෂුද්‍රජීව විද්‍යාව සහ ආසාදනය 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
බවර් ටී., ඩුරේ පී. (2023). ප්‍රොපියොනික් අම්ල නිපදවන බැක්ටීරියා වල කායික විද්‍යාව පිළිබඳ නව අවබෝධයක්: නිර්වායු ප්‍රොපියොනිකම් සහ නිර්වායු නියෝප්‍රොපියොනිකම් (කලින් ක්ලොස්ට්‍රිඩියම් ප්‍රොපියොනිකම් සහ ක්ලොස්ට්‍රිඩියම් නියෝප්‍රොපියොනිකම්). ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් 11, 685. doi: 10.3390/ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). මාතෘ පෝෂණය සහ කලලරූපය වර්ධනය කිරීම. J Nutr. 134, 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
බෙන්ජමිනි, වයි., සහ හොච්බර්ග්, ජේ. (1995). ව්‍යාජ-ධනාත්මක අනුපාතය පාලනය කිරීම: බහු පරීක්ෂණ සඳහා ප්‍රායෝගික සහ කාර්යක්ෂම ප්‍රවේශයක්. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x