Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රව්සර් අනුවාදයේ CSS සඳහා සීමිත සහයක් ඇත. හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රව්සරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රිය කරන්න). මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාස සහ JavaScript නොමැතිව අඩවිය ප්‍රදර්ශනය කරන්නෙමු.
පෘෂ්ඨවංශීන් මෙන් නොව, කෘමීන්ට පුරුෂ-පක්ෂග්‍රාහී ලිංගික ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන නොමැති බව පුළුල් ලෙස සැලකේ. ඇනොෆිලස් ගැම්බියාවේ, එක්ඩිසෝන් ස්ටෙරොයිඩ් 20-හයිඩ්‍රොක්සිඑක්ඩිසෝන් (20E) කාන්තාවන් විසින් සංස්ලේෂණය කරන විට බිත්තර වර්ධනය පාලනය කිරීමට සහ පිරිමින් විසින් ලිංගිකව මාරු කරන විට සංසර්ග වර්තන කාල පරිච්ඡේදයක් ඇති කිරීමට පරිණාමය වී ඇති බව පෙනේ3. බිත්තර වර්ධනය සහ සංසර්ගය අත්‍යවශ්‍ය ප්‍රජනක ලක්ෂණ වන බැවින්, ගැහැණු ඇනොෆිලස් මදුරුවන් මෙම හෝමෝන සංඥා ඒකාබද්ධ කරන ආකාරය තේරුම් ගැනීමෙන් නව මැලේරියා පාලන වැඩසටහන් සැලසුම් කිරීමට පහසුකම් සැලසිය හැකිය. මෙහිදී, මෙම ප්‍රජනන ක්‍රියාකාරකම් එක්ඩිස්ටෙරොයිඩ්-සක්‍රීය කිරීමේ/අක්‍රිය කිරීමේ එන්සයිම සංකීර්ණ ජාලයක් හරහා වෙනස් ලිංගික ස්ටෙරොයිඩ් මගින් නියාමනය කරනු ලබන බව අපි හෙළි කරමු. ලිංගික හුවමාරුවෙන් පසු සහ ඩිෆොස්ෆොරයිලේෂන් මගින් සක්‍රිය කිරීමෙන් පසු කාන්තා ලිංගික ප්‍රතිග්‍රාහකත්වය වසා දැමීමෙන් දෙමාපියන් ආරක්ෂා කරන පිරිමි-විශේෂිත ඔක්සිකරණය වූ එක්ඩිසෝන්, 3-ඩිහයිඩ්‍රෝ-20E (3D20E) අපි හඳුනා ගත්තෙමු. සැලකිය යුතු ලෙස, 3D20E හුවමාරුව ප්ලාස්මෝඩියම් ආසාදනය අතරතුර බිත්තර වර්ධනය පවත්වා ගන්නා ප්‍රජනක ජාන ප්‍රකාශනය ද ඇති කළ අතර, ආසාදිත කාන්තාවන්ගේ සෞඛ්‍යය සහතික කරයි. ගැහැණු-ව්‍යුත්පන්න 20E ලිංගික ප්‍රතිචාරයක් ඇති නොකරයි, නමුත් 20E-නිෂේධනය කරන කයිනේස් නිෂේධනය කිරීමෙන් පසු සංසර්ගයේ යෙදෙන පුද්ගලයින්ට බිත්තර දැමීමට ඉඩ සලසයි. මෙම පිරිමි-විශේෂිත කෘමි ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝනය හඳුනා ගැනීම සහ කාන්තා ලිංගික ප්‍රතිග්‍රාහකත්වය, සශ්‍රීකත්වය සහ ප්ලාස්මෝඩියම් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා නියාමනය කිරීමේදී එහි කාර්යභාරය මැලේරියාව සම්ප්‍රේෂණය කරන මදුරුවන්ගේ ප්‍රජනන සාර්ථකත්වය අඩු කිරීමේ විභවය යෝජනා කරයි.
මැලේරියා රෝගීන් සහ මරණ නැවතත් ඉහළ යමින් පවතී4 මිනිස් මැලේරියා පරපෝෂිතයන්ගේ එකම වාහකයා වන ඇනොෆිලස් මදුරුවන්ගේ පුළුල් කෘමිනාශක ප්‍රතිරෝධය හේතුවෙන්. මෙම මදුරුවන්ගේ සංසර්ග ජීව විද්‍යාව නව මැලේරියා පාලන මැදිහත්වීම් සඳහා විශේෂයෙන් ආකර්ශනීය ඉලක්කයකි, මන්ද ගැහැණු සතුන් එක් වරක් පමණක් සංසර්ගයේ යෙදෙන බැවිනි5; මෙම තනි සංසර්ග සිදුවීම වඳ කිරීම ක්ෂේත්‍රයේ මදුරු ගහනය අඩු කිරීමට විශාල විභවයක් ඇත.
පිරිමින්ගෙන් ඉහළ ටයිටර් ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන ලබා ගැනීමෙන් පසු කාන්තාවන් ලිංගිකව අකර්මණ්‍ය වේ. තවදුරටත් සංසර්ගයේ දුෂ්කරතා ඇති කරන ප්‍රේරකය 20-හයිඩ්‍රොක්සික්ඩිසෝන් (20E) බව අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත, එය කීට අවධියේදී දියවන චක්‍රයේ නියාමකයෙකු ලෙස වඩාත් හොඳින් හැඳින්වෙන ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝනයකි. පිරිමින්ට 20E සංස්ලේෂණය කිරීමට සහ මාරු කිරීමට ඇති හැකියාව විශේෂයෙන් පරිණාමය වී ඇත්තේ සෙලියා7 උප කුලයට අයත් ඇනොෆිලිස් විශේෂවල වන අතර එය අප්‍රිකාවේ බෙදා හරින අතර ඇනොෆිලිස් ගැම්බියාව ඇතුළු මැලේරියාවේ භයානකම වාහකයන් ඇතුළත් වේ. මෙය විශේෂයෙන් සැලකිය යුතු කරුණක් වන්නේ මෙම විශේෂවල කාන්තාවන් සෑම රුධිර ආහාර වේලකටම පසුව 20E නිපදවන අතර 20E ඕජෙනසිස් චක්‍රය මෙහෙයවන බැවිනි (යොමුව 8 බලන්න). කෙසේ වෙතත්, කාන්තාවන් තමන්ගේම සංසර්ගයේ හැකියාවට හානියක් නොකර එක්ඩිසෝන් ප්‍රභවයන් දෙකකින් (පිරිමි මාරු කිරීම සහ රුධිර පෝෂණය ප්‍රේරණය) සංඥා ඒකාබද්ධ කරන ආකාරය ගැන එතරම් දැනුමක් නැත. ඇත්ත වශයෙන්ම, කාන්තාවන් විසින් නිපදවන 20E ලිංගික නොඉවසීම ඇති කරයි නම්, මෙය කන්‍යාවන් පෝෂණය කරන පුද්ගලයින් තුළ වඳභාවයට හේතු වනු ඇත, මෙම මදුරුවන් තුළ ඉතා පොදු හැසිරීමකි5.
විය හැකි පැහැදිලි කිරීමක් නම්, A. ගැම්බියා පිරිමි සතුන් විසින් වෙනස් කරන ලද පිරිමි-විශේෂිත එක්ඩිසෝන් මාරු කරන අතර එය කාන්තා ප්‍රජනක පත්‍රිකාවේ සංඥා කඳුරැල්ලක් සක්‍රීය කරන අතර එමඟින් සංසර්ග අස්ථාවරත්වයක් ඇති වේ. කෙසේ වෙතත්, පෘෂ්ඨවංශීන්ට එස්ටජන් සහ ඇන්ඩ්‍රොජන් වැනි බහු ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන තිබුණද (යොමුව 9 හි සමාලෝචනය කර ඇත), අපගේ දැනුමට අනුව, කෘමීන් තුළ ඇන්ඩ්‍රොජනික්-පක්ෂග්‍රාහී ස්ටෙරොයිඩ් හඳුනාගෙන නොමැත.
ලිංගිකව පරිණත වූ A. ගැම්බියාගේ පිරිමි පිරිමි උපාංග ග්‍රන්ථියේ (MAG) ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝනවල එකතුව තීරණය කිරීමට අපි කටයුතු කළෙමු. කලින් භාවිතා කළ අඩු නිශ්චිත ක්‍රමයට වඩා ඉහළ කාර්යසාධනයක් සහිත ද්‍රව වර්ණදේහය ටැන්ඩම් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (HPLC-MS/MS) සමඟ සම්බන්ධ කර, මෙම පටකයේ එක්ඩිසෝන් (E) සහ 20E අනාවරණය කර ගත් අතර, පෙර ප්‍රතිඵලය තහවුරු කළේය. කෙසේ වෙතත්, සාම්පලය 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 සූත්‍රයට අනුකූලව ඔක්සිකරණය වූ පොස්පරීකරණය කරන ලද ස්ටෙරොයිඩ් මගින් ආධිපත්‍යය දැරීය (රූපය 1). අනෙකුත් ආකාරවලට 3-dehydro-20E (3D20E) සහ 20E-22-phosphate (20E22P) ඇතුළත් වේ. 3D20E22P හි HPLC-MS/MS සංඥා තීව්‍රතාවය එහි ඩිෆොස්ෆොරයිලේටඩ් ආකාරය වන 3D20E ට වඩා විශාලත්වයේ අනුපිළිවෙලවල් දෙකක් සහ E සහ 20E ට වඩා විශාලත්වයේ අනුපිළිවෙලවල් තුනක් වැඩි විය (රූපය 1).ශරීරයේ අනෙකුත් කොටස්වල සහ පහළ ප්‍රජනක පත්‍රිකාවේ වුවද (LRT; විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 1a). අලුතින් වසා දැමූ (<දින 1) පිරිමි සහ ගැහැණු සතුන් තුළ එක්ඩිස්ටෙරොයිඩ් විශ්ලේෂණය කළ අතර MAG හි පමණක් 3D20E සහ 3D20E22P අනාවරණය විය; E, 20E සහ 20E22P ස්ත්‍රී පුරුෂ දෙපාර්ශවයේම දක්නට ලැබුණි (විස්තීරණ දත්ත රූපය 1b).මෙම දත්තවලින් පෙනී යන්නේ A. ගැම්බියාවේ වැඩිහිටි පිරිමින් කාන්තාවන් විසින් සංස්ලේෂණය නොකරන ලද ඔවුන්ගේ MAG වල වෙනස් කරන හෝමෝනවල ඉහළ ටයිටර් නිපදවන බවයි.
MAG සහ ගැහැණු LRT (ඇට්‍රියා, ශුක්‍ර තරලය සහ පැරෝවේරියම් ඇතුළුව) දින 4ක් වයසැති (දින 4ක් වයසැති) කන්‍යා පිරිමින්ගෙන් සහ කන්‍යා සහ සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු (0.5, 3, සහ 12 hpm) ගෙන් විච්ඡේදනය කරන ලදී. මෙම පටක වල ඇති එක්ඩිසෝන් HPLC-MS/MS මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (මධ්‍යන්‍ය ± සෙම්; යුගල නොකළ t-පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික, ව්‍යාජ සොයාගැනීමේ අනුපාතය (FDR) නිවැරදි කරන ලදී; NS, සැලකිය යුතු නොවේ; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: පැය 3 vs. පැය 0.5, P = 0.035; පැය 12 vs. පැය 3, P = 0.0015; පැය 12 vs. පැය 0.5, P = 0.030. 3D20E22P: පැය 3 vs. පැය 0.5, P = 0.25; පැය 12 vs. පැය 3, P = 0.0032; පැය 12 vs. පැය 0.5, P = 0.015).දත්ත ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ තුනකින් ලබාගෙන ඇත. උනන්දුවක් දක්වන එක් එක් එක්ඩිසෝන් සඳහා උපරිම ප්‍රදේශය මදුරුවන් සංඛ්‍යාව අනුව ගණනය කර සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී. එක්ඩිසෝන් පහත පරිදි වර්ණයෙන් නිරූපණය කෙරේ: E, කොළ; 20E, තැඹිලි; 20E22P, දම්; 3D20E, නිල්; 3D20E22P, රෝස. ඇතුළත් කිරීම y-අක්ෂයේ පරිමාණය වැඩි කර අඩු එක්ඩිසෝන් මට්ටම් පෙන්වයි.
සංසර්ගයේදී 3D20E22P සහ 3D20E මාරු කරන්නේද යන්න විමර්ශනය කිරීම සඳහා, අපි සංසර්ගයෙන් පසු විවිධ කාල ලක්ෂ්‍යවලදී ගැහැණු LRT විච්ඡේදනය කළෙමු. කන්‍යාවන් තුළ එක්ඩිසෝන් හමු නොවූවත්, සංසර්ගයෙන් පසු වහාම LRT හි 3D20E22P සැලකිය යුතු ප්‍රමාණයක් (සංසර්ගයෙන් පසු පැය 0.5, hpm) අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, කාලයත් සමඟ අඩු වන අතර 3D20E මට්ටම් සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 1). රසායනිකව සංස්ලේෂණය කරන ලද 3D20E සම්මතයක් ලෙස භාවිතා කරමින්, සංසර්ගයේ LRT වල මෙම ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝනයේ මට්ටම් 20E ට වඩා අවම වශයෙන් 100 ගුණයකින් වැඩි බව අපි තීරණය කළෙමු (විස්තීරණ දත්ත වගුව 1). මේ අනුව, 3D20E22P යනු සංසර්ගයේදී ගැහැණු LRT වෙත මාරු කරන ප්‍රධාන පිරිමි එක්ඩිසෝන් වන අතර, එහි ඩිෆොස්ෆරයිලේටඩ් ස්වරූපය වන 3D20E, සංසර්ගයෙන් ටික කලකට පසු ඉතා බහුල වේ. මෙය කාන්තා සංසර්ගයෙන් පසු ජීව විද්‍යාවේ අවසාන එක්ඩිසෝන් සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් යෝජනා කරයි.
අභිරුචි-සාදන ලද ජෛව තොරතුරු නල මාර්ගයක් භාවිතා කරමින්, නව RNA අනුක්‍රමික (RNA-seq) දත්ත කට්ටලයක් ජනනය කිරීමෙන් පසු (රූපය 2a), අපි ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO) සහ 20E-වෙනස් කරන ලද පොස්පේටේස් ජානය කේතනය කරන ecdysone සඳහා සෙව්වෙමු. EPP) ප්‍රජනක පටක වල ප්‍රකාශ වේ. අපි එක් අපේක්ෂක EPP ජානයක් සහ විභව EcK ජාන දෙකක් (EcK1 සහ EcK2) හඳුනා ගත්තෙමු, නමුත් හොඳ අපේක්ෂක EO ජානයක් සොයා ගැනීමට නොහැකි විය. විශේෂයෙන්, ගැම්බියානු MAG වල තනි EPP ජාන ඉහළ මට්ටම්වලින් (98.9 වන ප්‍රතිශතයකින්) ප්‍රකාශ වූ නමුත් කාන්තා LRT වල නොවේ (රූපය 2b), මෙම කාන්තා පටක වල 3D20E22P හි ඩිෆොස්ෆරයිලේෂන් සිදු වූ බැවින්, අපගේ අපේක්ෂාවන්ට පටහැනිව. එබැවින්, සංසර්ගය අතරතුර පිරිමි EPP මාරු කළ හැකි බව අපි විශ්වාස කරමු. ඇත්ත වශයෙන්ම, සංසර්ගයෙන් පසු කාන්තා ප්‍රෝටීනය ආවරණය කිරීම සඳහා අපි in vivo ස්ථායී සමස්ථානික ලේබල් කිරීම භාවිතා කළෙමු, කාන්තා කර්ණිකාව තුළ MS මගින් හඳුනාගත් එන්සයිමයක් (රූපය 2c සහ අතිරේක වගුව 1). MAG සහ සංසර්ග (නමුත් කන්‍යා නොවන) කාන්තා LRT වල EPP පැවතීම නිශ්චිත ප්‍රතිදේහ භාවිතයෙන් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 2d).
a, EcKs, EOs සහ EPPs කේතනය කරන ජාන සඳහා එක් එක් ලිංගයේ ප්‍රජනක පටක සෙවීම සඳහා අභිරුචි-සාදන ලද ජෛව තොරතුරු නල මාර්ගයක්. ඊතල අසල ඇති සංඛ්‍යා එක් එක් පියවරේදී පිරිමි සහ ගැහැණු අපේක්ෂකයින් සංඛ්‍යාව දක්වයි. මෙම විශ්ලේෂණයෙන් පිරිමින් තුළ ප්‍රකාශ වන එක් EPP ජානයක් (EPP) සහ එක් EcK ජානයක් (EcK1) සහ ස්ත්‍රී පුරුෂ දෙපාර්ශවයේම ප්‍රකාශ වන නමුත් අපේක්ෂක EO ජානයක් ලබා නොදෙන එක් EcK ජානයක් (EcK2) හඳුනා ගන්නා ලදී.b, කන්‍යා (V) සහ සංසර්ගයේ (M) ඇනොෆිලස් ගැම්බියාවේ සහ ඇනොෆිලස් ඇල්බිකන්ස් පටක වල අපේක්ෂක ජාන ප්‍රකාශනය සංසන්දනය කරන තාප සිතියම.Spca, සංසේචනය; MAGs, පිරිමින් තුළ උපාංග ග්‍රන්ථි; ශරීරයේ අනෙකුත් කොටස්, පියයුරු, පියාපත්, කකුල්, මේද සිරුරු සහ ස්ත්‍රී පුරුෂ දෙපාර්ශවයේම අභ්‍යන්තර අවයව සහ කාන්තාවන්ගේ ඩිම්බ කෝෂ ඇතුළුව. ගැම්බියාවේ MAG සහ කර්ණිකා යන දෙකෙහිම EcK2 ඉතා ඉහළ මට්ටමක පවතින අතර, EPP දක්නට ලැබෙන්නේ MAG.c හි පමණි, පිරිමි ශුක්‍රාණු කණ්ඩායම් 3, 12 සහ 24 hpm හි කාන්තා කර්ණිකා වෙත මාරු කිරීම පිළිබඳ ප්‍රෝටියෝමික් විශ්ලේෂණය, එය වඩාත් බහුල ප්‍රෝටීන 67 පෙන්වයි. සියලුම ප්‍රෝටීන ලේබල් කිරීමට (සහ ආවරණය කිරීමට) 15N අඩංගු ආහාර වේලක් මත කාන්තාවන් ඇති දැඩි කරන ලදී. ටැග් නොකළ පිරිමින් ටැග් කළ කාන්තාවන් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදුණු අතර, ප්‍රෝටියෝමික් විශ්ලේෂණය සඳහා ගැහැණු LRT 3, 12 සහ 24 hpm හි විච්ඡේදනය කරන ලදී (ශුක්‍රාණු ප්‍රෝටීන පිළිබඳ සම්පූර්ණ ලැයිස්තුවක් සඳහා අතිරේක වගුව 1 බලන්න). මෙම පටක වල ප්‍රෝටියෝමික් විශ්ලේෂණය මගින් කන්‍යා පිරිමින්ගේ MAG හි ඇතුළත් කිරීම, EPP, Eck1 සහ EcK2 අනාවරණය විය.d, EPP සංසර්ගයේ යෙදුණු කාන්තාවන්ගේ MAG සහ LRT හි බටහිර බ්ලොට් මගින් අනාවරණය විය, නමුත් කන්‍යා කාන්තාවන් හෝ පිරිමින් හෝ ගැහැණුන්ගේ ඉතිරි කොටසෙහි නොවේ. ශරීරය. පටල එකවර ප්‍රති-ඇක්ටින් (පූරණ පාලනය) සහ ප්‍රති-EPP ප්‍රතිදේහ සමඟ පරීක්ෂා කරන ලදී. සියලුම පිරිමින් කන්‍යාවන් ය. ජෙල් ප්‍රභව දත්ත සඳහා අතිරේක රූපය 1 බලන්න. සමාන ප්‍රතිඵල සමඟ බටහිර බ්ලොට් දෙවරක් සිදු කරන ලදී.
MAG වලින් හුදකලා කරන ලද 3D20E22P සමඟ HPLC-MS/MS මගින් EPP හි එක්ඩිස්ටෙරොයිඩ් පොස්ෆොස්ෆොස්පේටේස් ක්‍රියාකාරිත්වය තහවුරු කරන ලදී (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 2a). තවද, අපි RNA-මැදිහත් වූ මැදිහත්වීම් (RNAi) මගින් EPP නිශ්ශබ්ද කළ විට, මෙම පිරිමින්ගේ ප්‍රජනක පටක වල පොස්පේටේස් ක්‍රියාකාරිත්වයේ ප්‍රබල අඩුවීමක් අපට අනාවරණය විය (රූපය 3a), සහ EPP-නිශ්ශබ්ද කළ පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදුණු කාන්තාවන් සැලකිය යුතු ලෙස පෙන්නුම් කළේ අර්ධ ජාන නිශ්ශබ්ද කිරීම තිබියදීත්, ඩිෆොස්ෆොරයිලේටඩ් 3D20E හි අඩු අනුපාතයක් (රූපය 3b) (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 2b,c). ඊට වෙනස්ව, අපි එම මදුරුවන් තුළම 20E22P/20E අනුපාතයේ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය කර නොගත් අතර, එන්සයිමය 3D20E22P සඳහා විශේෂිත බව යෝජනා කළ හැකිය (රූපය 3b).
a, ද්විත්ව නූල් සහිත EPP RNA (dsEPP) හෝ ද්විත්ව නූල් සහිත GFP RNA (dsGFP) පාලන භාවිතයෙන් EPP නිශ්ශබ්ද කිරීම නිසා MAG හි පොස්පේටේස් ක්‍රියාකාරිත්වය අඩු වීම. එක් එක් අනුරුවෙහි MAG තටාක විස්සක් භාවිතා කරන ලදී (P = 0.0046, යුගල කළ t-පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික), වෙනම තිත් මගින් නිරූපණය කෙරේ.b, EPP-නිශ්ශබ්ද කළ පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදුණු කාන්තාවන්ට 3 hpm හි dephosphorylated 3D20E හි සැලකිය යුතු ලෙස අඩු අනුපාතයක් තිබුණි (P = 0.0043, යුගල නොකළ t-පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික), නමුත් 20E මට්ටම් බලපෑමට ලක් නොවීය (P = 0.063, යුගල නොකළ). t-පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික). ගැහැණු සතුන් 13, 16 සහ 19 බැගින් වූ තටාක තුනකින් දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± sem ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ.c, EPP-නිශ්ශබ්ද කළ පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු සතුන්ට නැවත සංසර්ගයේ සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ අනුපාත තිබුණි (P = 0.0002, ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික). ඔවුන්ගේ සංසර්ග තත්ත්වය සහතික කිරීම සඳහා කාන්තාවන්ට මුලින්ම සංසර්ගයට බල කරන ලදී; දින 2 කට පසු, සංක්‍රාන්ති ශුක්‍රාණු රැගෙන යන අනෙකුත් පිරිමින් සමඟ ඔවුන් සම්බන්ධ කර ගන්නා ලදී.d., EPP-නිහඬ කළ පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදුණු රුධිරය පෝෂණය කළ ගැහැණු සතුන්ගේ සාරවත් බව සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී තිබුණි (P < 0.0001; මෑන්-විට්නි පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික) සහ බිත්තර සංඛ්‍යාව තරමක් අඩු වී තිබුණි (P = 0.088, මෑන්-විට්නි පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික), බිත්තර දැමීමේ අනුපාතයට බලපෑමක් සිදු නොවූ අතර (P = 0.94, ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික). සියලුම පැනල් වල, n යනු ජීව විද්‍යාත්මකව ස්වාධීන මදුරු සාම්පල ගණන නියෝජනය කරයි.NS, සැලකිය යුතු නොවේ.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
ඊළඟට, කාන්තාවන් තුළ සංසර්ග ප්‍රතිරෝධය ඇති කිරීම සඳහා එක්ඩිසෝන් ඩිෆොස්ෆරයිලේෂන් වැදගත් දැයි අපි තක්සේරු කළෙමු. සැලකිය යුතු ලෙස, අතිරේක (සංක්‍රාන්ති) පිරිමින්ට නිරාවරණය වන විට පාලක ගැහැණු සතුන්ට (10.4%) වඩා බොහෝ ඉහළ සංඛ්‍යාතයකින් (44.9%) නැවත සංසර්ගයේ යෙදෙන EPP-ක්ෂය වූ පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදෙන ගැහැණු සතුන් (රූපය 3c). අපි සශ්‍රීකත්වයේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් (රූපය 3d, වමේ) සහ මෙම ගැහැණු සතුන් විසින් දමන ලද බිත්තර සංඛ්‍යාවේ සුළු අඩුවීමක් (රූපය 3d, මැද) ද නිරීක්ෂණය කළ අතර, කාන්තාවන් විසින් දමන ලද බිත්තර ප්‍රතිශතය (සංසර්ගය මගින් කාන්තාවන් තුළ ඇති කරන තවත් ප්‍රතිචාරයක්)) බලපෑමට ලක් නොවීය (රූපය 3d, දකුණේ). 3D20E22P සඳහා EPP හි නිරීක්ෂණය කරන ලද නිශ්චිතභාවය අනුව, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ සංසර්ගය අතරතුර මාරු කරන ලද EPP මගින් 3D20E සක්‍රිය කිරීම තවදුරටත් සංසර්ගයට කාන්තා ප්‍රතිග්‍රාහකත්වය අක්‍රිය කිරීමේදී වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කළ හැකි බවයි, එය කලින් 20E හි ලිංගික හුවමාරුවට ආරෝපණය කරන ලද හැසිරීමකි. එබැවින්, මෙම පිරිමි-විශේෂිත හෝමෝනය කාන්තා සශ්‍රීකත්වයට ද දැඩි ලෙස බලපායි.
ඊළඟට, රසායනිකව සංස්ලේෂණය කරන ලද 3D20E (රූපය 4a-c) සහ වාණිජමය වශයෙන් ලබා ගත හැකි 20E භාවිතා කරමින් ලිංගිකව පරිණත වූ කන්‍යාවන් තුළ එන්නත් කිරීමේ අත්හදා බැලීම් වලදී 20E සහ 3D20E හි ක්‍රියාකාරකම් අපි සංසන්දනය කළෙමු. සාන්ද්‍රණ දෙකෙහිම සංසර්ගයට කාන්තා සංවේදීතාව වසා දැමීමේදී 3D20E 20E ට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස ඵලදායී බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 4d). සැලකිය යුතු ලෙස, LRT හි 3D20E හි භෞතික විද්‍යාත්මක මට්ටමෙන් අඩක් (එන්නත් කිරීමෙන් පසු pg 1,066 vs. සංසර්ගයෙන් පසු pg 2,022) ඉහළම සාන්ද්‍රණයකින් එන්නත් කිරීමෙන් පැය 24 කට පසු 20E (එන්නත් කිරීමෙන් පසු pg 361) භෞතික විද්‍යාත්මක මට්ටමට වඩා 20 ගුණයකින් වැඩි පරාවර්තක ගැහැණු අනුපාතයක් ඇති කළේය. සංසර්ගයෙන් පසු pg 18 pg ඉහළම සාන්ද්‍රණයකින් එන්නත් කිරීමෙන් පැය 24 කට පසු; විස්තීරණ දත්ත වගුව 1).මෙම ප්‍රතිඵලය 20E හි ලිංගික හුවමාරුව සංසර්ග වර්තන කාල පරිච්ඡේද ඇති නොකරයි යන සංකල්පයට අනුකූල වන අතර, දෙමාපිය-ළමා සම්බන්ධතාවය සහතික කිරීමේ ප්‍රධාන සාධකයක් ලෙස 3D20E තවදුරටත් පෙන්වා දෙයි. කන්‍යා කාන්තාවන් තුළ බිත්තර දැමීමේ පරීක්ෂණ වලදී 3D20E 20E ට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස ක්‍රියාකාරී විය (රූපය 4e), අර්ධ EPP නිශ්ශබ්දතාවයෙන් පසුව අප නිරීක්ෂණය කළ සාමාන්‍ය බිත්තර දැමීමේ අනුපාතය සංසර්ගයෙන් ඇති කරන ලද කාන්තා සාධක මගින් තවමත් නිපදවන අවශේෂ 3D20E ක්‍රියාකාරකම් පැවතීම නිසා බව යෝජනා කරයි.
(a,b) 20E (a) වලින් රසායනිකව සංස්ලේෂණය කරන ලද 3D20E ඉතා ඉහළ පරිවර්තනය/කාර්යක්ෂමතාවයකින් (ස්වාධීන සංස්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියා තුනකින් මධ්‍යන්‍ය ± sem ලෙස ඉදිරිපත් කරන ලද දත්ත) (b).c, ස්කන්ධ වර්ණාවලිය (පහළ භාගය) සංසර්ගයේ යෙදුණු කාන්තා LRT (ඉහළ භාගය) හි ඇති එක්ඩිසෝන් සමඟ හරියටම ගැලපේ.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික) සහ 10% එතනෝල් (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික) සමඟ සසඳන විට, 20E ඉහළ මාත්‍රාවලින් පමණක් පාලනයට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික).e, 3D20E එන්නත් කිරීම 10% එතනෝල් පාලනවලට වඩා කන්‍යා කාන්තාවන් තුළ සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ බිත්තර දැමීමේ අනුපාත ඇති කළේය (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික), 20E පාලන සමඟ සසඳන විට ඉහළ මාත්‍රාවලින් පමණි (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික).3D20E ඉහළ මාත්‍රාවලින් 20E ට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ බිත්තර දැමීමේ අනුපාත ඇති කළේය (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය, ද්වි-පාර්ශ්වික).සියලුම පැනල් වල, n ජීව විද්‍යාත්මකව ස්වාධීන මදුරු සාම්පල ගණන නියෝජනය කරයි.NS, නොවේ සැලකිය යුතු.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. දත්ත අනුපිටපත් තුනකින් ලබාගෙන ඇත.
පෙර අධ්‍යයනයන්හිදී, ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝනවල ලිංගික හුවමාරුව MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) ප්‍රකාශනය ඇති කරන බව අපි තීරණය කළෙමු, එය A. gambiae කාන්තාවන් P. falciparum ආසාදනයෙන් ආරක්ෂා කරන කාන්තා ප්‍රජනක ජානයකි. මාරාන්තික මානව මැලේරියා පරපෝෂිතයා වන 13 නිසා ඇතිවන සෞඛ්‍ය පිරිවැය. මැලේරියා ආවේණික ප්‍රදේශවල ඇනොෆිලස්ගේ ප්‍රජනන යෝග්‍යතාවයට MISO හි වැදගත්කම සැලකිල්ලට ගෙන, මෙම ජානයේ ප්‍රකාශනය අවුලුවන හෝමෝනය 3D20E හෝ 20E තීරණය කිරීමට අපි තීරණය කළෙමු. 20E එන්නත් කිරීම HR3 සහ HR4 වැනි සමහර න්‍යෂ්ටික හෝමෝන ප්‍රතිග්‍රාහක (HR) සහ කහ මදය ජාන Vg14, 15, 16 වැනි සාමාන්‍ය පහළ ස්ටෙරොයිඩ් ඉලක්ක විශේෂයෙන් හෝ වඩාත් ප්‍රබල ලෙස ප්‍රේරණය කළ අතර, MISO වඩාත් ප්‍රබල ලෙස ප්‍රේරණය කරන ලද්දේ 3D20E (විස්තීරණ දත්ත රූපය 3) විසිනි. මේ අනුව, මෙම ඇන්ඩ්‍රොජනික් ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝනයේ ලිංගික හුවමාරුව පරපෝෂිත ආසාදන මගින් ඇති කරන පිරිවැයෙන් කාන්තාවන් ආරක්ෂා කරන යාන්ත්‍රණයන් ඇති කරන බව පෙනේ. තවද, 3D20E E ප්‍රතිග්‍රාහකයේ EcR හි සමස්ථානික දෙකටම වෙනස් ලෙස බලපාන අතර, EcR-A ප්‍රේරණය කරන අතර EcR-B මර්දනය කරන අතර, කාන්තා සශ්‍රීකත්වයට බලපාන HPX15 ඇතුළු අනෙකුත් සංසර්ග-ප්‍රේරක ජාන වඩාත් ප්‍රබල ලෙස අවුලුවයි. EPP-නිශ්ශබ්ද කළ පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයේ යෙදෙන කාන්තාවන් තුළ නිරීක්ෂණය වන සැලකිය යුතු වඳභාවය මෙයින් පැහැදිලි කළ හැකිය (විස්තීරණ දත්ත රූපය 3). මෙම දත්ත මඟින් ලිංගික-විශේෂිත ක්‍රියාකාරිත්වයට යටින් පැවතිය හැකි එක්ඩිසෝන් හෝමෝන දෙකක් මගින් මනාප ලෙස සක්‍රිය කරන ලද පහළ මාර්ගවල පැවැත්ම යෝජනා කරයි.
ඊළඟට, අපගේ ජෛව තොරතුරු නල මාර්ගයේ හඳුනාගත් EcK ජාන දෙකෙහි ක්‍රියාකාරිත්වය අපි පරීක්ෂා කළෙමු. EcK1 හෝ EcK2 නිශ්ශබ්ද කිරීමෙන් පිරිමින් තුළ සැලකිය යුතු මරණ සංඛ්‍යාවක් සිදු විය (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 4a), එමඟින් එක්ඩිසෝන් පොස්පරීකරණය සහ එමඟින් අක්‍රිය වීම පැවැත්ම සඳහා වැදගත් බව යෝජනා විය. EcK2 EcK1 ට වඩා ඉහළ මට්ටම්වලින් ප්‍රකාශ වූ අතර ප්‍රෝටියෝමික්ස් මගින් MAG වල අනාවරණය වූ නිසා (රූපය 2b,c සහ අතිරේක වගුව 2), අපි එය 20E සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමෙන් එහි එක්ඩිස්ටෙරොයිඩ් කයිනේස් ක්‍රියාකාරිත්වය වලංගු කළෙමු, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස පොස්පරීකරණය 20E22P (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 2) ඇති විය. 4b). 3D20E උපස්ථරයක් ලෙස භාවිතා කරන විට, අපට පොස්පරීකරණය කරන ලද නිෂ්පාදනය 3D20E22P (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 4c) හඳුනා ගැනීමට නොහැකි විය, එයින් යෝජනා කරන්නේ 3D20E වෙනුවට 20E EcK2 හි කැමති ඉලක්කය විය හැකි බවයි.
අපගේ RNA-seq විශ්ලේෂණයට අනුව, කන්‍යා කාන්තාවන්ගේ LRT හි EcK2 ද ඉහළ මට්ටමක ප්‍රකාශ වූ අතර, එහිදී සංසර්ගයෙන් පසු එය අක්‍රිය කරන ලදී (රූපය 2b). අපි මෙම දත්ත තහවුරු කළ අතර EcK2 ප්‍රකාශනයට රුධිර පෝෂණයෙන් බලපෑමක් නොමැති බව තීරණය කළෙමු (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 5a). අපගේ මූලික MS අත්හදා බැලීම් දිගු කිරීමෙන්, 20E22P හි උච්චතම අවස්ථාව 20E හි උච්චතම අවස්ථාවට සමීපව සම්බන්ධ බව අපි තීරණය කළෙමු (රුධිර ආහාර වේලෙන් පැය 22-26 කට පසු; විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 5b). කන්‍යා කාන්තාවන් තුළ EcK2 නිශ්ශබ්ද කිරීම රුධිර ආහාර වේලෙන් පැය 26 කට පසු 20E සිට 20E22P දක්වා සාපේක්ෂ අනුපාතය 3 ගුණයකින් වැඩි කිරීමට හේතු විය (විස්තීර්ණ දත්ත රූප 2c සහ 5c), EcK2 කාන්තාවන් තුළ 20E පොස්පරයිලේට් කරන බව තහවුරු කරයි. සැලකිය යුතු ලෙස, EcK2-ක්ෂය වූ කන්‍යාවන් සම්පූර්ණ ලිංගික ප්‍රතිග්‍රාහකත්වය පවත්වා ගෙන ගියේය (විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 5d,e), තවදුරටත් යෝජනා කරන්නේ 20E හි කාන්තා නිෂ්පාදනය සංසර්ග වර්තනය ඇති නොකරන බවයි. ඔසප් වීම.කෙසේ වෙතත්, මෙම ගැහැණු සතුන් පාලනයන්ට සාපේක්ෂව බිත්තර දැමීමේ අනුපාතය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වී ඇති අතර, කන්‍යාවන්ගෙන් 30% කට වඩා බිත්තර දමයි (දිගු කළ දත්ත රූපය 5f).රුධිර පෝෂණයෙන් පසු ද්විත්ව නූල් සහිත Eck2 RNA (dsEcK2) එන්නත් සිදු කළේ නම්, බිත්තර දැමීම සිදු නොවූ අතර, එම අවස්ථාවේදී රුධිරය ශරීරගත වීම හේතුවෙන් 20E උච්චතම අවස්ථාව අඩු වී තිබුණි.සමස්තයක් වශයෙන්, මෙම ප්‍රතිඵල රුධිරය උරා ගැනීමෙන් පසු නිපදවන 20E බිත්තර දැමීම ඇති කළ හැකි ආකෘතියකට සහය දක්වයි, නමුත් බිත්තර දැමීමේ කොටස (EcK2 සහ සමහර විට වෙනත් සාධක) සංසර්ගය මගින් අක්‍රිය කළ විට පමණි.20E හෝ 3D20E එන්නත් කන්‍යාවන්හි EcK2 ප්‍රකාශනය වළක්වන්නේ නැත (දිගු කළ දත්ත රූපය 5g), මෙම කයිනේස් නිෂේධනයට වෙනත් සාධක මැදිහත් වන බව යෝජනා කරයි.කෙසේ වෙතත්, රුධිර පෝෂණයෙන් පසු 20E මට්ටම් සංසර්ගයේ අපහසුතාවයන් ඇති කිරීමට ප්‍රමාණවත් නොවූ නමුත් ලිංගිකව මාරු කරන ලද 3D20E හි ඉහළ ටයිටර මගින් ඵලදායී ලෙස අවුලුවන ලදී.
අපගේ ප්‍රතිඵල A. ගැම්බියාවේ ප්‍රජනන සාර්ථකත්වය නියාමනය කරන යාන්ත්‍රණයන් පිළිබඳ වැදගත් අවබෝධයක් ලබා දෙයි. පිරිමින් 3D20E හි ඉහළ ටයිටර සංස්ලේෂණය කිරීමට පරිණාමය වී ඇති ආකෘතියක් මතු වී ඇත, එය ගැහැණු සතුන් තවදුරටත් සංසර්ගය සඳහා සංවේදී නොවන බවට පත් කිරීමෙන් දෙමාපියන් සහතික කරන පිරිමි-විශේෂිත වෙනස් කරන ලද එක්ඩිසෝන් වේ. ඒ සමඟම, මෙම මැලේරියා වාහකයන් පිරිමි-විශේෂිත EPP හි ලිංගික හුවමාරුවට ප්‍රතිචාර වශයෙන් කාන්තාවන් තුළ 3D20E සක්‍රිය කිරීමට කාර්යක්ෂම පද්ධතියක් ද පරිණාමය කර ඇත. අපගේ දැනුමට අනුව, කෘමීන් තුළ අද්විතීය හා තීරණාත්මක කාර්යයක් ඉටු කරන පිරිමි සහ ගැහැණු ආධිපත්‍යය දරන ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන පද්ධතියක පළමු උදාහරණය මෙයයි. පිරිමි-විශේෂිත එක්ඩිසෝන් ක්‍රියාකාරිත්වය උපකල්පනය කර ඇත නමුත් නිශ්චිතවම පෙන්නුම් කර නොමැත. උදාහරණයක් ලෙස, බොහෝ දුරට ප්‍රතික්ෂේප කරන ලද කල්පිතයක් 18 නම්, මෙම කාර්යයන් 20E පූර්වගාමියා E1 මගින් සිදු කළ හැකි බවයි. ඩ්‍රොසෝෆිලා හි, මොනැන්ඩ්‍රි කුඩා ලිංගික පෙප්ටයිඩවල ලිංගික හුවමාරුව මගින් අවුලුවන බව හොඳින් දන්නා කරුණකි19,20 එය නිශ්චිත ලිංගික පෙප්ටයිඩ හරහා කාන්තා ප්‍රජනක පත්‍රිකාව නවීකරණය කරන නියුරෝන සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කරයි. receptors21,22. A. gambiae ගැහැණු සතුන් තුළ 3D20E මගින් පාලනය වන පහළට සංඥා කඳුරැල්ල තීරණය කිරීමට සහ මෙම කඳුරැල්ල මදුරුවන් සහ ඩ්‍රොසෝෆිලා අතර සංරක්ෂණය කළ හැකිද යන්න තීරණය කිරීමට තවදුරටත් කටයුතු අවශ්‍ය වේ.
අපගේ අධ්‍යයනයේ දී හඳුනාගෙන ඇති කාන්තා සශ්‍රීකත්වය සහ හැසිරීම් සඳහා 3D20E හි වැදගත් කාර්යභාරය සැලකිල්ලට ගෙන, 3D20E සංස්ලේෂණය සහ සක්‍රිය කිරීමට මඟ පාදන මාර්ග අනාගත මදුරු පාලන උපාය මාර්ග සඳහා නව අවස්ථා ලබා දෙයි, එනම් වඳ කෘමි තාක්‍ෂණ උපාය මාර්ගවල තරඟකාරී වඳ පිරිමින් උත්පාදනය කිරීම වැනි. වල් මුදා හැරීම සඳහා භාවිතා කිරීම හෝ කන්‍යා ක්‍රීඩාවේදී 3D20E අනුකරණය කිරීම. A. ගැම්බියා සහ අනෙකුත් සෙලියා විශේෂ ඔවුන්ගේ ශුක්‍රාණු සංසර්ග ප්ලග් බවට කැටි ගැසීමේ හැකියාව ලබා ගත් විට 3D20E හි පිරිමි-විශේෂිත ක්‍රියාකාරිත්වය පරිණාමය වී ඇති අතර, මෙය විශාල හෝමෝන සහ හෝමෝන-සක්‍රීය එන්සයිම කාර්යක්ෂමව මාරු කිරීමට ඉඩ සලසයි. අනෙක් අතට, 3D20E පරිණාමය ක්‍රියාත්මක කිරීම මොනැන්ඩ්‍රි කාන්තාවන්ට (MISO හි ඉහළ ප්‍රකාශනය හරහා) ඉහළ මැලේරියා ව්‍යාප්තියක් ඇති ප්‍රදේශවල ඔවුන්ගේ ප්‍රජනන යෝග්‍යතාවයට අනුග්‍රහය දැක්වීමට යාන්ත්‍රණයක් සපයයි, එය වක්‍රව ප්ලාස්මෝඩියම් සම්ප්‍රේෂණයට දායක වේ. ගැහැණු ඇනොෆිලස් මදුරුවන් තුළ P. ෆැල්සිපරම් වල පැවැත්ම සහ වර්ධනය කෙරෙහි ගැහැණු 20E ප්‍රගාाव බලපෑම් ඇති කරන බව පෙන්වා දී ඇති හෙයින්, 24 පිරිමි සහ ගැහැණු ස්ටෙරොයිඩ් හෝමෝන මාර්ග දෙකම දැන් මදුරු-පරපෝෂිත අන්තර්ක්‍රියා වල ප්‍රධාන අංග වේ.
A. ගැම්බියා G3 වික්‍රියා සම්මත කෘමි තත්වයන් යටතේ (26-28 °C, සාපේක්ෂ ආර්ද්‍රතාවය 65-80%, ආලෝක/අඳුරු ප්‍රකාශ කාලපරිච්ඡේදය පැය 12:12) ඇති කරන ලදී. කීටයන්ට කුඩු කළ මාළු ආහාර (ටෙට්‍රාමින් නිවර්තන පෙති, කොයි පෙති සහ ටෙට්‍රා පොකුණු කූරු 7:7:2 අනුපාතයකින්) ලබා දෙන ලදී. වැඩිහිටි මදුරුවන්ට ඇඩ් ලිබිටම් 10% ඩෙක්ස්ට්‍රෝස් ද්‍රාවණය සහ සතිපතා මිනිස් රුධිරය ලබා දෙන ලදී (රුධිර සංරචක අධ්‍යයනය කරන්න). අන්වීක්ෂය මගින් කෙළවර පරීක්ෂා කිරීමෙන් පසු රූකඩ අවධියේදී ලිංග වෙන් කිරීමෙන් කන්‍යා මදුරුවන් ලබා ගන්නා ලදී. DsRed සංක්‍රාන්ති ජානය රැගෙන යන පිරිමින් කලින් විස්තර කර ඇත.
කලින් විස්තර කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලවලට අනුව බලහත්කාරයෙන් සංසර්ග අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලදී. ස්වාභාවික සංසර්ගය සඳහා, දින 4 ක් වයසැති කන්‍යා ගැහැණු සතුන් ලිංගිකව පරිණත වූ කන්‍යා පිරිමින් සමඟ 1:3 අනුපාතයකින් රාත්‍රී දෙකක් තබා ගන්නා ලදී. පිරිමින්ට dsEPP එන්නත් කරන ලද අත්හදා බැලීම් සඳහා, පොස්පේටේස් ක්‍රියාකාරිත්වය උපරිම ලෙස නිශ්ශබ්ද කළ විට, එන්නත් කිරීමෙන් පසු 3-4 දින සමඟ සම-කූඩු කිරීම සමපාත විය (විස්තීරණ දත්ත රූපය 2b).
මදුරු පටක, ඉතිරි මළ සිරුරු (ශරීරයේ ඉතිරි කොටස) හෝ මුළු ශරීරයම 100% මෙතනෝල් බවට විච්ඡේදනය කර බීඩරයක් (මිලිමීටර් 2 වීදුරු පබළු, 2,400 rpm, තත්පර 90) සමඟ සමජාතීය කරන ලදී. පටක ප්‍රමාණයන් සහ මෙතනෝල් පරිමාවන් පහත පරිදි විය: ශරීරයේ ඉතිරි කොටස, 1,000 µl න් 50; MAG, 50–100 80 µl; ගැහැණු LRT, 25–50 80 µl. අවක්ෂේපය එකම පරිමාවකින් මෙතනෝල් සමඟ දෙවන මෙතනෝල් නිස්සාරණයකට භාජනය කරන ලදී. සෛල සුන්බුන් කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් ඉවත් කරන ලදී. නිස්සාරණ දෙකෙන්ම මෙතනෝල් ඒකාබද්ධ කර නයිට්‍රජන් ප්‍රවාහය යටතේ වියළා, පසුව ජලයේ 80% මෙතනෝල් පරිමාවෙන් නැවත රඳවා තබන ලදී: ශරීරයේ ඉතිරි කොටස, 50 µl; MAGs සහ ගැහැණු LRT, 30 µl.
සාම්පල ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් (ID-X, Thermo Fisher) LC උපකරණයකට (Vanquish, Thermo Fisher) සම්බන්ධ කර විශ්ලේෂණය කරන ලදී. 25 °C දී පවත්වා ගෙන යන 3 µm, 100 × 4.6 mm තීරුවකට (Inspire C8, Dikma) සාම්පලයෙන් 5 µl එන්නත් කරන ලදී. LC සඳහා ජංගම අදියර A (ජලය, 0.1% ෆෝමික් අම්ලය) සහ B (ඇසිටොනයිට්‍රයිල්, 0.1% ෆෝමික් අම්ලය) විය. LC අනුක්‍රමණය පහත පරිදි විය: මිනිත්තු 1 ක් සඳහා 5% B, පසුව මිනිත්තු 11 ක් තුළ 100% B දක්වා වැඩි විය. 100% දී මිනිත්තු 8 කට පසු, මිනිත්තු 4 ක් සඳහා 5% B හි තීරුව නැවත සමතුලිත කරන්න. ප්‍රවාහ අනුපාතය 0.3 ml min-1 විය. MS ප්‍රභවයේ අයනීකරණය ධනාත්මක සහ සෘණ ආකාරවලින් රත් වූ විද්‍යුත් ඉසින අයනීකරණය මගින් සිදු කෙරේ.
ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය සම්පූර්ණ MS මාදිලියේ 60,000 විභේදනයකදී 350 සිට 680 දක්වා m/z පරාසයේ දත්ත මනිනු ලබයි. [M + H]+ (සියලුම ඉලක්ක), [M - H2O + H]+ (සියලුම ඉලක්ක) සහ [M - H]- (පොස්පරීකරණය කරන ලද ඉලක්ක) මත MS/MS දත්ත ලබා ගන්නා ලදී. කිසිදු ප්‍රමිතියක් නොමැති ඉලක්කවල එක්ඩිසෝන් ගුණාංග තහවුරු කිරීමට MS/MS දත්ත භාවිතා කරන ලදී. ඉලක්කගත නොවන එක්ඩිස්ටෙරොයිඩ් හඳුනා ගැනීම සඳහා, >15% සාපේක්ෂ බහුලත්වයක් ඇති සියලුම HPLC උච්ච සඳහා MS/MS දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී. එක් නිශ්චිත සාම්පලයක (අනෙකුත් සියලුම ඉලක්ක) නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණ හෝ තනුක ගණනය කිරීම සඳහා පිරිසිදු ප්‍රමිතීන්ගෙන් (20E, 3D20E) නිර්මාණය කරන ලද සම්මත වක්‍ර භාවිතා කරමින් ප්‍රමාණනය කරන්න, එක් පිරිමියෙකු තුළ සොයාගත් ප්‍රමාණයන්ට සමානතාවය ගණනය කිරීම සඳහා. 3D20E සඳහා, පහත සඳහන් ඇඩක්ට් වල එකතුව භාවිතා කරමින් ප්‍රමාණනය සිදු කරන ලදී: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Tracefinder (අනුවාදය 4.1) භාවිතයෙන් දත්ත උපුටා ගෙන ප්‍රමාණනය කරන ලදී.Xcalibur (අනුවාදය 4.4) භාවිතයෙන් MS/MS දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.E, 20E සහ 3D20E හි MS වර්ණාවලි අදාළ ප්‍රමිතීන්ට සංසන්දනය කරන ලදී.3D20E22P ගිරාඩ්ගේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකය සමඟ ව්‍යුත්පන්න කිරීමෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.20E22P m/z අනුපාතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
MAG වලින් 3D20E22P පිරිසිදු කරන ලදී. HPLC-MS/MS විශ්ලේෂණයට සමාන LC තත්වයන් යටතේ චතුරස්‍රාකාර ස්කන්ධ-පාදක අනාවරකයක් (QDa, Acquity, Waters) සහිත අතිශය ක්‍රියාකාරී ද්‍රව වර්ණදේහයක් (Acquity, Waters) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණාත්මක පරිමාණයකින් පිරිසිදු කිරීම සිදු කරන ලදී. කලින් තීරණය කළ පරිදි එකම රඳවා ගැනීමේ අවස්ථාවේදීම 3D20E22P ට අනුරූප වන m/z අනාවරණය වූ විට භාග එකතු කිරීම අවුලුවන ලදී. ඉන්පසු නිස්සාරණය කරන ලද සංයෝගවල සංශුද්ධතාවය ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි HPLC-MS/MS මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී.
නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුගමනය කරමින් TRI ප්‍රතික්‍රියාකාරකය (තාප ෆිෂර්) භාවිතයෙන් ප්‍රජනක පටක 10-12 කින් හෝ ශරීරයේ අනෙකුත් කොටස් (හිස රහිත) වලින් මුළු RNA නිස්සාරණය කරන ලදී. RNA TURBO DNase (තාප ෆිෂර්) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලදී. නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුගමනය කරමින් cDNA මොලෝනි මුරීන් ලියුකේමියා වෛරස් ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් (M-MLV RT; තර්මෝ ෆිෂර්) භාවිතයෙන් සංස්ලේෂණය කරන ලදී. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රමාණාත්මක PCR (RT-qPCR; විස්තීරණ දත්ත වගුව 2) සඳහා ප්‍රයිමර් කලින් ප්‍රකාශයට පත් කරන ලදී24 නැතහොත් ප්‍රයිමර්-BLAST26 භාවිතයෙන් නිර්මාණය කරන ලද අතර, ප්‍රමාණයෙන් 70-150 bp නිෂ්පාදන සහ විහිදෙන එක්සොන්-එක්සොන් හන්දි හෝ ප්‍රයිමර් යුගල ප්‍රයිමර් වෙනම එක්සොන් සඳහා මනාප ලබා දෙන ලදී. ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ තුනේ සිට හතර දක්වා cDNA සාම්පල RT-qPCR සඳහා ජලයේ හතර ගුණයකින් තනුක කරන ලදී. 1× PowerUp SYBR හරිත මාස්ටර් මිශ්‍රණය (තාප ෆිෂර්), ප්‍රයිමර් සහ තනුක කළ cDNA 5 µl අඩංගු 15 µl අනුරූ ප්‍රතික්‍රියා වලදී ප්‍රමාණනය සිදු කරන ලදී. ප්‍රතික්‍රියා ක්‍රියාත්මක කරන ලද්දේ a මත ය. QuantStudio 6 Pro තත්‍ය කාලීන PCR පද්ධතිය (Thermo Fisher) සහ දත්ත එකතු කර විශ්ලේෂණය කරන ලද්දේ සැලසුම් සහ විශ්ලේෂණය (අනුවාදය 2.4.3) භාවිතයෙන් ය. මෙම අධ්‍යයනයේ දී පෙන්නුම් කළ පරිදි, සාපේක්ෂ ප්‍රමාණ රයිබසෝම ජානය RpL19 (AGAP004422) ට සාමාන්‍යකරණය කරන ලද අතර, එහි ප්‍රකාශනය රුධිරය පෝෂණය කිරීම 27 හෝ සංසර්ගය 3 සමඟ සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවීය.
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) භාවිතයෙන් RNA ගුණාත්මකභාවය පරීක්ෂා කරන ලදී. Illumina යුගල-අන්ත පුස්තකාල සකස් කර MIT සහ Harvard හි Broad Institute හි ක්‍රියාත්මක කරන ලදී. අනුක්‍රමික කියවීම් A. gambiae ජෙනෝමයට (PEST strain, අනුවාදය 4.12) පෙරනිමි පරාමිතීන් සමඟ HISAT2 (අනුවාදය 2.0.5) භාවිතා කරමින් පෙළගස්වන ලදී. සිතියම්ගත කිරීමේ ගුණාත්මකභාවය (MAPQ) ලකුණු <30 සහිත කියවීම් Samtools (අනුවාදය 1.3.1) භාවිතයෙන් ඉවත් කරන ලදී. ජානවලට සිතියම්ගත කළ කියවීම් ගණන පෙරනිමි පරාමිතීන් සමඟ htseq-count (අනුවාදය 0.9.1) භාවිතා කර ගණනය කරන ලදී. සාමාන්‍යකරණය කළ කියවීම් ගණන් ගණනය කරන ලද අතර R (අනුවාදය 4.0.3) හි DESeq2 පැකේජය (අනුවාදය 1.28.1) භාවිතා කර අවකල ජාන ප්‍රකාශනය විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
PSI-BLAST ඇල්ගොරිතමය (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) භාවිතයෙන් A. gambiae ජෙනෝමය මුලින්ම සෙවීමෙන් Ecdysone-වෙනස් කරන ජාන අපේක්ෂකයින් හඳුනා ගන්නා ලදී. පෙරනිමි අගයන් භාවිතා කරමින් පහත සඳහන් විමසුම් ප්‍රෝටීන් අනුපිළිවෙල සහිත පරාමිතීන්: Bombyx mori (ප්‍රවේශ අංකය NP_001038956.1), Musca domestica (ප්‍රවේශ අංකය XP_005182020.1, XP_005175332.1 සහ XP_011294434.1) සහ Microplitis demolitor (ප්‍රවේශ අංකය XP_008552646.1 සහ XP_008552645.1) වෙතින් EcK. B. mori (ප්‍රවේශ අංකය NP_001036900), Drosophila melanogaster (ප්‍රවේශ අංකය NP_651202), Apis mellifera (Access No. XP_394838) සහ Acyrthosiphon pisum (Access No. XP_001947166); සහ B. mori (Access No. XP_001947166) NP_001177919.1 සහ NP_001243996.1) සහ D. melanogaster හි EO (Access No. NP_572986.1) වෙතින් EPP (පියවර 1). ඊළඟට, ගැම්බියාවේ (2 වන පියවර) ප්‍රජනක පටක (කාන්තා LRT හෝ MAG) හි ඉහළ mRNA ප්‍රකාශනය (> මිලියනයකට කොටස් 100/කිලෝබේස් එක්සෝන සිතියම්ගත කියවීම් (FPKM) හෝ >85%) මත පදනම්ව පෙරහන් පහර දෙයි. නිශ්චිතතාව වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා, අපි සංසර්ගයේදී එක්ඩිසෝන් සංස්ලේෂණය නොකරන හෝ මාරු නොකරන ඇනොෆිලස් විශේෂයක් වන A. ඇල්බිමනස් හි ප්‍රජනක පටක වල ද ප්‍රකාශ වන අපේක්ෂක එන්සයිම තෝරා ගත්තෙමු. A. ඇල්බිමනස් ප්‍රජනක පටක වල (පියවර 3) අඩු ප්‍රකාශනය (<100 FPKM හෝ <85 වන ප්‍රතිශතය) මත පදනම්ව අපේක්ෂක ජාන පෙරහන් කරන ලදී. අවසාන පෙරහනක් ලෙස (පියවර 4), අපේක්ෂක ජාන පහත සඳහන් දේවලින් අවම වශයෙන් එකක්වත් සපුරාලිය යුතුය: (1) වෙනස් ලෙස ප්‍රකාශිත ජාන විශ්ලේෂණයට අනුව සංසර්ගයෙන් පසු සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නියාමනය කරන ලද (P < 0.05) සහ (2) ප්‍රජනක නොවන පටක වල (<85 % හෝ <100 FPKM).
සම්පූර්ණ ජීවියාගේ සමස්ථානික ලේබල් කිරීම සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා අපි කලින් විස්තර කළ ක්‍රම 28,29,30 වෙනස් කළෙමු. කෙටියෙන් කිවහොත්, වල්-වර්ගයේ සැචරෝමයිසස් සෙර්විසියා වර්ගය II (YSC2, සිග්මා) නයිට්‍රජන් වල එකම ප්‍රභවය ලෙස (wt/vol) 2% ග්ලූකෝස් (G7528, සිග්මා), 1.7% ඇමයිනෝ අම්ල-නිදහස් සහ ඇමෝනියම් සල්ෆේට්. සංස්කෘතික මාධ්‍යය) සහ 5% 15N ඇමෝනියම් සල්ෆේට් (NLM-713, >99%, කේම්බ්‍රිජ් සමස්ථානික රසායනාගාර) අඩංගු යීස්ට් නයිට්‍රජන් පදනම (BD Difco, DF0335) තුළ පරීක්ෂා කරන ලදී. යීස්ට් කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් ප්‍රතිසාධනය කරන ලද අතර මදුරු කීටයන්ට pupation තෙක් නිදහසේ පෝෂණය කරන ලදී. සිව්වන ක්ෂණික මරණ වැළැක්වීම සඳහා මාළු පිටි (කීටයන් 300 කට 0.5 mg) සමඟ අතිරේකය. සංසර්ගය අතරතුර මාරු කරන ලද පිරිමි ප්‍රෝටෝමය විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා ලේබල් නොකළ පිරිමින් සමඟ සංසර්ග අත්හදා බැලීම් වලදී කාන්තාවන් පමණක් භාවිතා කරන ලදී.
දින 4-6ක් වයසැති 15N-ටැග් කරන ලද කන්‍යා ගැහැණු සතුන් වයසට ගැලපෙන ටැග් නොකළ කන්‍යා පිරිමින් සමඟ සංසර්ගයට බල කරන ලදී. එපිෆ්ලෝරසන්ස් අන්වීක්ෂය යටතේ සංසර්ග ප්ලග් හඳුනා ගැනීමෙන් සාර්ථක සංසර්ගය සත්‍යාපනය කරන ලදී. 3, 12 සහ 24 hpm වලදී, සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු සතුන් 45-55 දෙනෙකුගේ කර්ණිකා ඇමෝනියම් බයිකාබනේට් බෆරයේ 50 µl (pH 7.8) බවට විච්ඡේදනය කර පළිබෝධයක් සමඟ සමජාතීය කරන ලදී. සමජාතීය කේන්ද්‍රාපසාරී කර 50 mM ඇමෝනියම් බයිකාබනේට් හි 0.1% RapiGest (186001860, Waters) හි 50 µl සමඟ සුපර්නේටන්ට් මිශ්‍ර කරන ලදී. එක් එක් සාම්පලයෙන් සුපිරිනේටන්ට් සහ පෙති වියළි අයිස් මත ශීත කළ අතර එක රැයකින් වොෂින්ටන් විශ්ව විද්‍යාලයේ මැකෝස් රසායනාගාරයට නැව්ගත කරන ලද අතර එහිදී LC-MS/MS සඳහා සාම්පල සකස් කිරීම අවසන් විය. 50 mM ඇමෝනියම් හි 0.1% RapiGest හි 50 µl හි පෙති නැවත සවි කරන්න. ජල ස්නානයක බයිකාබනේට් සහ සොනිකේට්. පෙති සහ සුපර්නේටන්ට් වල ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය BCA විශ්ලේෂණය මගින් මනිනු ලැබූ අතර, සාම්පල 5 mM ඩයිතියෝත්‍රයිටෝල් (DTT; සිග්මා) සමඟ අඩු කරන ලද අතර, 15 mM අයඩෝඇසිටමයිඩ් (සිග්මා) සමඟ ඇල්කයිලීකරණය කර ට්‍රිප්සිනීකරණය: ට්‍රිප්සින්:උපස්ථර අනුපාතය සමඟ පැය 1 ක් 37 °C (1:0 50) දී ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. සුන්බුන් ඉවත් කිරීම සඳහා 37 °C දී විනාඩි 45 ක් සහ 4 °C දී විනාඩි 10 ක් 14,000 rpm දී කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම මගින් RapiGest ලයිස් කරන ලදී. සාම්පල ද්විත්ව මාදිලියේ ඝන-අදියර නිස්සාරණය (Oasis MCX කාට්රිජ්, වෝටර්ස්) මගින් සෝදා 0.33 µg µl-1 අවසාන ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය සඳහා 0.1% ෆෝමික් අම්ලයේ නැවත සවි කරන ලදී. ලේබල් නොකළ MAG ප්‍රෝටීන කන්‍යා පිරිමින්ගෙන් ද ඒ හා සමානව විශ්ලේෂණය කරන ලදී. දෙකක් එක් එක් සාම්පලය සඳහා විශ්ලේෂණාත්මක අනුරූ විශ්ලේෂණය කරන ලදී. ඊළඟට, ජුපිටර් C12 ප්‍රතිලෝම-අදියර දුම්මල (ෆීනොමෙක්ස්) සහ මිනිත්තු 180 ක ද්‍රව වර්ණදේහයෙන් පිරුණු 4-සෙ.මී. විලයන සිලිකා Kasil1 (PQ) ෆ්‍රිට් උගුලක් සහිත 25-සෙ.මී. විලයන සිලිකා 75-μm තීරුවක් භාවිතයෙන් එක් එක් 1 µg විශ්ලේෂණය කරන ලදී. සාම්පල සංග්‍රහ - MS/MS නැනෝ ACQUITY UPLC පද්ධතියක් (Waters) සහිත Q-Exactive HF ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් (Thermo Fisher) මත ධාවනය කරන ලදී. එක් එක් ධාවනය සඳහා ජනනය කරන ලද දත්ත ආශ්‍රිත අත්පත් කර ගැනීමේ දත්ත Proteowizard (අනුවාදය 3.0.20287) භාවිතයෙන් සහ Anopheles gambiae (VectorBase අනුවාදය 54), Anopheles coluzzi වෙතින් ප්‍රෝටීන් අනුපිළිවෙල අඩංගු FASTA දත්ත සමුදායට එරෙහිව Comet31 (අනුවාදය 3.2) භාවිතයෙන් mzML ආකෘතියට පරිවර්තනය කරන ලදී. Mali-NIH (VectorBase අනුවාදය 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, මාර්තු 2021), A. gambiae RNA-seq සහ දන්නා මානව දූෂකවල රාමු තුනක පරිවර්තන මත සෙවීමක් සිදු කරන ලදී. පෙප්ටයිඩ් සිතියම්-ගැලපෙන FDRs 0.01 සීමාවක් සහිත Percolator32 (අනුවාදය 3.05) භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලද අතර, ප්‍රෝටීන් parsimony භාවිතයෙන් පෙප්ටයිඩ ප්‍රෝටීන් හඳුනාගැනීම් වලට එකලස් කරන ලදී. Limelight33 (අනුවාදය 2.2.0). කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි, එක් එක් ධාවනයේදී එක් එක් ප්‍රෝටීනය සඳහා ගණනය කරන ලද සාමාන්‍යකරණය කරන ලද වර්ණාවලි බහුලතා සාධකය (NSAF) භාවිතයෙන් සාපේක්ෂ ප්‍රෝටීන් බහුලත්වය ඇස්තමේන්තු කරන ලදී. එක් එක් ප්‍රෝටීනයට සාපේක්ෂව NSAF විවිධ ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ දෙකකින් සාම්පල හරහා සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී. ලේබල් කරන ලද කන්‍යාවන්ගෙන් ලේබල් නොකළ ප්‍රෝටීන් කුඩා ප්‍රමාණයක් අනාවරණය කර ගත හැකි වුවද, 15N ලේබල් කිරීම කාන්තා ප්‍රෝටෝමය සාර්ථකව ආවරණය කළේය. HPLC “ඉදිරියට ගෙන යාම” හේතුවෙන් අමු සාම්පල පිරිමි/සංසර්ග සාම්පල පසු ධාවනය කරන ලද තාක්ෂණික ධාවනයන්හිදී පමණක් කාන්තා අමු සාම්පලවල පිරිමි ප්‍රෝටීන් අඩු කිරීම (1-5 වර්ණාවලි) හඳුනා ගැනීම අපි වාර්තා කළෙමු. ලේබල් කරන ලද කන්‍යාවන්ගෙන් 'දූෂක' ලෙස සොයාගත් ඉඳහිට ප්‍රෝටීන අතිරේක වගුව 1 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත.
Genscript හි ප්‍රතිදේහජනක පෙප්ටයිඩ දෙකක්, QTTDRVAPAPDQQQ (සමස්ථානික PA තුළ) සහ MESDGTTPSGDSEQ (සමස්ථානික PA සහ PB තුළ). පෙප්ටයිඩ දෙක ඒකාබද්ධ කර, පසුව වාහක ප්‍රෝටීනය KLH සමඟ සංයෝජන කර නවසීලන්ත හාවුන්ට එන්නත් කරන ලදී. සිව්වන එන්නතෙන් පසු හාවන් පූජා කරන ලද අතර, සම්පූර්ණ IgG සම්බන්ධතා පිරිසිදු කිරීම මගින් හුදකලා කරන ලදී. වඩාත් EPP-විශේෂිත හාවාගෙන් IgG තවදුරටත් බටහිර බ්ලොටින් සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
බටහිර පැල්ලම් සඳහා, දින 4 ක් වයසැති කන්‍යා පිරිමි සහ කන්‍යා හෝ බලහත්කාරයෙන් සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු සතුන්ගෙන් (<10 සංසර්ගයෙන් පසු) MAG (n = 10, එහිදී n ජීව විද්‍යාත්මකව ස්වාධීන මදුරු සාම්පල ගණන නියෝජනය කරයි) සහ ගැහැණු LRT (n = 30), ප්‍රෝටීන් නිස්සාරණ බෆරය (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% සෝඩියම් ඩිඔක්සිකොලේට්; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× ප්‍රෝටීස් නිෂේධක කොක්ටේල් (රෝචේ)) වෙන වෙනම එකතු කරන ලදී. බීඩරයක් සමඟ විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසු සාම්පල වහාම සමජාතීය කරන ලදී (2 mm වීදුරු පබළු, 2,400 rpm, තත්පර 90). 4 °C දී 20,000 g දී කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් දිය නොවන සුන්බුන් ඉවත් කරන ලදී. බ්‍රැඩ්ෆර්ඩ් විශ්ලේෂණය (ජෛව-රැඩ්) මගින් ප්‍රෝටීන් ප්‍රමාණනය කරන ලදී. ඉන්පසු, MAG ප්‍රෝටීන් 20 µg, LRT ප්‍රෝටීන් 40 µg, සහ අවශේෂ තොග ප්‍රෝටීන 20 µg ක් MOPS බෆරය භාවිතයෙන් 10% Bis-Tris NuPAGE මගින් ස්වභාවධර්මය අඩු කර වෙන් කරන ලදී. iBlot2 හුවමාරු පද්ධතිය (Thermo Fisher) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් පොලිවයිනයිලයිඩීන් ෆ්ලෝරයිඩ් පටල වෙත මාරු කරන ලදී. පටල 1× PBS-T (PBS හි 0.1% Tween-20) තුළ දෙවරක් සෝදා, පසුව Odyssey අවහිර කිරීමේ බෆරයේ (Li-Cor) පැය 1 ක් 22°C දී අවහිර කරන ලදී. පටල 4 °C දී එක රැයකින් හාවා විරෝධී EPP පොලික්ලෝනල් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය (අවහිර කිරීමේ බෆරයේ 1:700) සහ මීයන් විරෝධී ඇක්ටින් මොනොක්ලෝනල් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය MAC237 (Abeam; 1:4,000) සමඟ සොලවන ලදී. පටල PBS-T සමඟ සෝදා, පසුව ද්විතියික ප්‍රතිදේහ (බූරු විරෝධී හාවා 800CW සහ එළු විරෝධී මීයන් 680LT (Li-Cor), දෙකම 1:20,000) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. 0.01% අඩංගු අවහිර කිරීමේ බෆරයේ. 22 °C දී පැය 1ක් සඳහා SDS සහ 0.2% Tween -20. පටල PBS-T මගින් සෝදා Odyssey CLx ස්කෑනරයක් භාවිතයෙන් රූපගත කරන ලදී. රූප එකතු කර Image Studio (5.2 අනුවාදය) තුළ සකසන ලදී. EPP-RA isoform (82 kDa) ට අනුරූප වන නිශ්චිත කලාපයක් අනාවරණය නොවීය.
EPP හි කේතීකරණ කලාප (හිස්ටයිඩින් පොස්පේටේස් වසම අඩංගු අයිසෝෆෝම් AGAP002463-RB ලෙස, NCBI සංරක්ෂිත වසම් සෙවුම් 34) සහ EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) ප්ලාස්මිඩ් (Novagen Millipore Sigma) බවට ක්ලෝන කරන ලදී; ප්‍රයිමර් විස්තීරණ දත්ත වගුව 2 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. pET-21a(+)-EcK2 ගොඩනැගීමේ C-පර්යන්ත 6xHis ටැගයට පෙර GS4 සම්බන්ධක අටක් (එකට) ඇතුළත් කරන ලදී. NEBExpress සෛල-නිදහස් E. coli ප්‍රෝටීන් සංස්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාව (New England BioLabs) භාවිතයෙන් නැවත සංයෝජක ප්‍රෝටීන නිපදවන ලදී. NEBExpress Ni භ්‍රමණ තීරු (New England BioLabs) භාවිතයෙන් නැවත සංයෝජක ප්‍රෝටීන පිරිසිදු කරන ලදී. NEBExpress සෛල-නිදහස් E. coli ප්‍රෝටීන් සංස්ලේෂණ කට්ටලයෙන් DNA සැකිල්ල භාවිතයෙන් ඩයිහයිඩ්‍රොෆොලේට් රිඩක්ටේස් (DHFR) පාලන ප්‍රෝටීනය නිපදවන ලදී. ප්‍රෝටීන PBS හි -20 °C දී මාස 3ක් දක්වා -20 °C දී 50% ග්ලිසරෝල් හි මාස 3ක් දක්වා ගබඩා කරන ලදී.
EPP සහ පටක නිස්සාරකවල පොස්පේටේස් ක්‍රියාකාරිත්වය 4-නයිට්‍රොෆීනයිල් පොස්පේට් (pNPP; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) භාවිතයෙන් මනිනු ලැබීය. ප්‍රතික්‍රියා බෆරයේ 25 mM Tris, 50 mM ඇසිටික් අම්ලය, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA සහ 1 mM DTT අඩංගු විය. ප්‍රතික්‍රියා බෆරයේ පටක සමජාතීය කරන ලද අතර කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් සෛල සුන්බුන් ඉවත් කරන ලදී. 2.5 mg ml-1 pNPP අඩංගු ප්‍රතික්‍රියා බෆරයට එන්සයිම හෝ පටක සාරය එකතු කිරීමෙන් ප්‍රතික්‍රියාව ආරම්භ කරන්න. ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අඳුරේ දී පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද අතර, pNPP වලින් පරිවර්තනය කරන ලද pNP ප්‍රමාණය විවිධ කාලවලදී 405 nm හි අවශෝෂණය මැනීමෙන් ප්‍රමාණනය කරන ලදී.
in vitro EcK ක්‍රියාකාරිත්වය සඳහා, ප්‍රෝටීනය 0.2 mg 20E හෝ 3D20E සමඟ 200 µl බෆරයක (pH 7.5) 27 °C දී පැය 2 ක් සඳහා 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP සහ 10 mM MgCl2 අඩංගු කර ඇත. ප්‍රතික්‍රියාව 800 µl මෙතනෝල් එකතු කිරීමෙන් නතර කරන ලද අතර, පසුව පැය 1 ක් -20 °C දී සිසිල් කරන ලද අතර, පසුව 4 °C දී විනාඩි 10 ක් සඳහා 20,000 g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. ඉන්පසු සුපිරි ද්‍රව්‍යය HPLC-MS/MS මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. පාලන කාණ්ඩයේ භාවිතා කරන ප්‍රෝටීන තාප-අක්‍රිය කිරීම සඳහා, ප්‍රෝටීන PBS හි 50% ග්ලිසරෝල් තුළ 95 °C දී විනාඩි 20 ක් සඳහා ඉන්කියුබේට් කරන ලදී.
අභ්‍යන්තර EPP ක්‍රියාකාරිත්වය සඳහා, ප්‍රෝටීනය 3D20E22P (HPLC-MS/MS මගින් පිරිසිදු කරන ලද MAG යුගල 18 කින් සොයාගත් ප්‍රමාණයට සමාන) සමඟ 25 mM Tris, 50 mM ඇසිටික් අම්ලය, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, සහ 1 mM DTT අඩංගු 100 µl බෆරයක (pH 7.5) 27 °C දී පැය 3 ක් සඳහා ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. ප්‍රතික්‍රියාව 400 µl මෙතනෝල් එකතු කිරීමෙන් නතර කර පැය 1 ක් -20 °C දී සිසිල් කර, පසුව 20,000 g දී විනාඩි 10 ක් සඳහා 4 °C දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. සුපිරි ද්‍රව්‍යය HPLC-MS/MS මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
මිශ්‍ර ලිංගික හිස රහිත මදුරු මළ සිරුරු වලින් සකස් කරන ලද cDNA වලින් EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) සහ EcK2 (556 bp) සඳහා PCR කොටස් විස්තාරණය කරන ලදී. eGFP පාලනයේ PCR කොටස (495 bp) කලින් විස්තර කරන ලද pCR2.1-eGFP වලින් විස්තාරණය කරන ලදී; PCR ප්‍රයිමර් විස්තීරණ දත්ත වගුව 2 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. PCR කොටස pL4440 ප්ලාස්මිඩයේ ප්‍රතිලෝම T7 ප්‍රවර්ධක අතරට ඇතුළු කරන ලදී. ප්ලාස්මිඩ් නිර්මිතයන් NEB 5-α දක්ෂ E. coli (නිව් එංගලන්ත බයෝලැබ්ස්) වෙතින් ලබා ගන්නා ලද අතර භාවිතයට පෙර DNA අනුක්‍රමණය මගින් සත්‍යාපනය කරන ලදී (ඇතුළත් කිරීමේ අනුපිළිවෙල සඳහා අතිරේක දත්ත 1 බලන්න). T7 ප්‍රවර්ධකයට ගැලපෙන ප්‍රයිමර් (විස්තීරණ දත්ත වගුව 2) pL4440-පාදක ප්ලාස්මිඩයෙන් ඇතුළු කිරීම විස්තාරණය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. PCR නිෂ්පාදන ප්‍රමාණය ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් මගින් තහවුරු කරන ලදී. මෙගාස්ක්‍රිප්ට් T7 ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ෂන් කට්ටලය (තාප ෆිෂර්) භාවිතයෙන් PCR සැකිලි වලින් dsRNA පිටපත් කරන ලද අතර කලින් විස්තර කර ඇති වෙනස් කිරීම් සමඟ නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව පිරිසිදු කරන ලදී.
dsRNA එන්නත් කිරීම සඳහා, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 සාන්ද්‍රණයකින් වැඩිහිටි පිරිමි හෝ ගැහැණුන්ගේ (Nanoject III, Drummond) උරස් කුහරයට eclossion කිරීමෙන් දින 1ක් ඇතුළත එන්නත් කරන ලදී. RNA නිස්සාරණය, cDNA සංස්ලේෂණය සහ RT-qPCR මගින් අවම වශයෙන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ තුනකින් ජාන නිස්සාරණ මට්ටම් තීරණය කරන ලදී. ecdysone එන්නත් කිරීම සඳහා, දින 4ක් වයසැති කන්‍යා හෝ දින 6ක් වයසැති කන්‍යා රුධිරයෙන් පෝෂණය වූ කාන්තාවන්ට 20E හි 0.13, 0.21, හෝ 0.63 µg හෝ 3D20E (Nanoject III, Drummond) පිළිවෙලින් 1.3, 2.1 සාන්ද්‍රණයකින් එන්නත් කරන ලදී, පර්යේෂණාත්මක සැලසුම හෝ 6.3 ng nl-1 මත පදනම්ව. 10% කින් 100 nl එන්නත් කරන්න. (vol/vol) ජලයේ එතනෝල්; 10% එතනෝල් වල 3D20E22P 100 nl (MAG යුගලයකින් සොයාගත් ප්‍රමාණයෙන් 75% ට සමාන). එන්නත් කාණ්ඩයට අහඹු ලෙස මදුරුවන් පවරා ඇත.
බිත්තර දැමීමේ පරීක්ෂණ සඳහා, දින 3 ක් වයසැති ගැහැණු සතුන්ට මිනිස් රුධිරය මත නිදහසේ පෝෂණය කරන ලදී. අර්ධ වශයෙන් පෝෂණය කරන ලද හෝ පෝෂණය නොකළ මදුරුවන් ඉවත් කරන්න. ප්‍රතිකාරය මත පදනම්ව, රුධිර ආහාර වේලෙන් පසු අවම වශයෙන් පැය 48 ක් ඇතුළත ගැහැණු සතුන් වෙනම බිත්තර දැමීමේ කෝප්පවල රාත්‍රී හතරක් තබා ඇත. ස්ටීරියෝස්කෝප් යටතේ බිත්තර ගණන් කරන ලදී (ස්ටෙමි 508, සයිස්); සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු සතුන් සඳහා, කීටයන් බවට පත් වූ බිත්තර සාරවත් ලෙස සැලකේ.
සංසර්ග අත්හදා බැලීම් සඳහා, ප්‍රතිකාරය අනුව සංසර්ගයට ප්‍රතිරෝධය වර්ධනය කිරීම සඳහා ගැහැණු සතුන්ට අවම වශයෙන් දින 2 ක් ලබා දෙන ලද අතර, වල් වර්ගයේ වයසට ගැලපෙන පිරිමින් පසුව එම කූඩුවටම හඳුන්වා දෙන ලදී. රාත්‍රී දෙකකට පසු, ගැහැණු සංසේචනය කරන ලද වෙසිලිකා විච්ඡේදනය කරන ලද අතර, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, සහ 25 mM NaCl (pH 8.2) අඩංගු බෆරයක කැටි කිරීම-දියවීම සහ sonication මගින් ජෙනෝමික් DNA මුදා හරින ලදී. සාම්පල 55 °C දී මිනිත්තු 15 ක්, පසුව 95 °C දී මිනිත්තු 10 ක් ප්‍රෝටීනේස් K (0.86 µg µl-1) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. බොරතෙල් ජානමය DNA සූදානම 10 ගුණයකින් තනුක කර Y වර්ණදේහ අනුපිළිවෙල qPCR හඳුනා ගැනීමට භාජනය කරන ලදී; ප්‍රයිමර් විස්තීර්ණ දත්ත වගුව 2 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. Y වර්ණදේහ අනුපිළිවෙල නොමැති වීමෙන් සංසර්ගයක් නොමැති බව පෙන්නුම් කරයි.
නැවත සංසර්ග පරීක්ෂණ සඳහා, බලහත්කාරයෙන් සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු සතුන් සංසර්ග තත්ත්වය තහවුරු කිරීම සඳහා සංසර්ග ප්ලග් තිබීම සඳහා පරීක්ෂා කරන ලද අතර, පෙර විස්තර කර ඇති පරිදි 36. පිරිමින් නොමැති විට සංසර්ගයට වර්තන හැකියාව වර්ධනය කිරීමට දින 2 ක් ඉඩ දෙන ලදී. ඉන්පසු DsRed සංක්‍රාන්ති ශුක්‍රාණු රැගෙන යන පිරිමින් ගැහැණු කූඩුවලට හඳුන්වා දෙන ලදී. රාත්‍රී දෙකකට පසු, සංසේචනය වන වෙසිලිකා ගැහැණු සතුන්ගෙන් විච්ඡේදනය කරන ලද අතර, ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි ජෙනෝමික් DNA සකස් කර DsRed සංක්‍රාන්ති ජානයේ qPCR හඳුනාගැනීමකට භාජනය කරන ලදී; ප්‍රයිමර් විස්තීරණ දත්ත වගුව 2 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. DsRed සංක්‍රාන්ති ජානය නොමැති වීමෙන් පෙන්නුම් කළේ නැවත සංසර්ගයක් සිදු නොවූ බවයි.
3D20E කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි සංස්ලේෂණය කරන ලදී 37. කෙටියෙන් කිවහොත්, 20E (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) හි 10 mg ජලය මිලි ලීටර් 10 ක දියකර, පසුව ප්ලැටිනම් කළු මිලිග්‍රෑම් 30 ක් (කුඩු ආකාරයෙන්, සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) එකතු කරන ලදී. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී කලවම් කරන ලද ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයට O2 මෘදු ප්‍රවාහයක් අඛණ්ඩව බුබුලු දමන ලදී. පැය 6 කට පසු, ප්‍රතික්‍රියාව නැවැත්වීම සඳහා මෙතනෝල් මිලි ලීටර් 30 ක් එකතු කරන ලදී. උත්ප්‍රේරක අංශු ඉවත් කිරීම සඳහා මිශ්‍රණය කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී රික්තකයේ වියළීමට සුපිරි ද්‍රව්‍යය වාෂ්ප කරන ලදී. වියළි ප්‍රතික්‍රියා නිෂ්පාදනය HPLC-MS/MS විශ්ලේෂණය සඳහා එන්නත් කිරීම සඳහා 10% එතනෝල් සහ මෙතනෝල් වල දිය කරන ලදී. පරිවර්තන අනුපාතය (20E සිට 3D20E දක්වා) ආසන්න වශයෙන් 97% ක් විය (රූපය 4b), සහ සංස්ලේෂණය කරන ලද 3D20E හි MS වර්ණාවලිය සංසර්ගයේ යෙදුණු ගැහැණු සතුන් තුළ දක්නට ලැබුණු ඒවාට ගැලපේ (රූපය 4c).
පුරාවෘත්තයේ සිදු කරන ලද සංඛ්‍යානමය පරීක්ෂණ පිළිබඳ නිශ්චිත විස්තර අඩංගු වේ. ෆිෂර්ගේ නිරවද්‍ය පරීක්ෂණය, මැන්ටෙල්-කොක්ස් පරීක්ෂණය සහ ශිෂ්‍යයාගේ ටී-පරීක්ෂණය සිදු කිරීම සඳහා ග්‍රැෆ් පෑඩ් (අනුවාදය 9.0) භාවිතා කරන ලදී. කොක්‍රාන්-මැන්ටෙල්-හේන්ස්සෙල් පරීක්ෂණ අභිරුචි R ස්ක්‍රිප්ට් එකක් භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test හි ඇත). 0.05 ක වැදගත්කම සීමාවක් සහිත ෂැපිරෝ-විල්ක් පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් දත්ත ව්‍යාප්තිය සාමාන්‍යභාවය සඳහා පරීක්ෂා කරන ලදී. දත්ත සාමාන්‍යතා පරීක්ෂණයෙන් අසමත් වූ විට, මෑන්-විට්නි පරීක්ෂණය සිදු කරන ලදී. මැන්ටෙල්-කොක්ස් පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් පැවැත්මේ දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී. RNA-seq ජාන මට්ටමේ අවකල ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය සිදු කිරීම සඳහා DESeq2 පැකේජය (අනුවාදය 1.28.1) භාවිතා කරන ලදී. ප්‍රස්ථාරයේ තිරස් තීරුව මධ්‍යන්‍යය නියෝජනය කරයි. සියලුම පරීක්ෂණ සඳහා එළිපත්ත ලෙස P = 0.05 ක වැදගත්කම අගයක් භාවිතා කරන ලදී.
අධ්‍යයන සැලසුම පිළිබඳ වැඩිදුර තොරතුරු සඳහා, මෙම ලිපියට සම්බන්ධ කර ඇති Nature Research Report සාරාංශය බලන්න.
MS ප්‍රෝටෝමික් දත්ත, PRIDE සහකරු ගබඩාව (https://www.ebi.ac.uk/pride/) හරහා PXD032157 දත්ත කට්ටල හඳුනාගැනීම සමඟින් ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) වෙත තැන්පත් කරන ලදී.
RNA-seq දත්ත කට්ටලය GSE198665 අනුක්‍රමික වාර්තාව යටතේ ජාන ප්‍රකාශන විස්තීර්ණ පුස්තකාලයේ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) තැන්පත් කර ඇත.
වත්මන් අධ්‍යයනයේදී ජනනය කරන ලද සහ/හෝ විශ්ලේෂණය කරන ලද අතිරේක දත්ත කට්ටල සාධාරණ ඉල්ලීමක් මත අදාළ කතුවරුන්ගෙන් ලබා ගත හැක. මෙම ලිපිය මූලාශ්‍ර දත්ත සපයයි.
ඩි ලූෆ්, ඒ. එක්ඩිස්ටෙරොයිඩ්ස්: නොසලකා හරින ලද කෘමි ලිංගික ස්ටෙරොයිඩ්? පිරිමි: කළු පෙට්ටිය. කෘමි විද්‍යාව.13, 325–338 (2006).
රෙඩ්ෆර්න්, ඇනොෆිලස් ස්ටීවන්ස් හි CPF 20-හයිඩ්‍රොක්සිඑක්ඩිසෝන් සහ ඩිම්බකෝෂ වර්ධනය. ජේ. කෘමි කායික විද්‍යාව. 28, 97–109 (1982).