සෛල කොටස්කරණය සහ හෝමියස්ටැසිස් පවත්වා ගැනීම සඳහා ස්‍රාවය කරන මාර්ගයේ ප්‍රෝටීන් වර්ග කිරීම අත්‍යවශ්‍ය වේ. කවච-මැදිහත් වූ වර්ග කිරීමට අමතරව, ස්‍රාවය කරන ප්‍රවාහන ක්‍රියාවලියේදී කයිනසින් වර්ග කිරීමේදී ලිපිඩවල කාර්යභාරය තවමත් පිළිතුරු නොලැබුණු දිගුකාලීන මූලික ප්‍රශ්නයකි. මෙහිදී, ඉතා දිගු සෙරමිඩ් ලිපිඩ කොටස් සහිත අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද ග්ලයිකෝසයිල්ෆොස්ෆැටයිඩිලිනොසිටෝල්-නිශ්චල නොවන ප්‍රෝටීන පොකුරු කර විශේෂිත එන්ඩොප්ලාස්ම් වලට වර්ගීකරණය කර ඇති බව අපි vivo තුළ ඔප්පු කිරීම සඳහා 3D එකවර බහු වර්ණ අධි-විභේදන තත්‍ය කාලීන රූපකරණය සිදු කරමු. ශුද්ධ පිටවීමේ ස්ථානය, එය ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීන භාවිතා කරන දෙයට වඩා වෙනස් ය. ඊට අමතරව, එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් පටලයේ සෙරමිඩ් දාමයේ දිග මෙම වර්ග කිරීමේ තේරීම සඳහා ඉතා වැදගත් බව අපි පෙන්වමු. ලිපිඩ දාමයේ දිග මත පදනම්ව ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ ස්‍රාවය කරන මාර්ගයේ තෝරාගත් අපනයන ස්ථාන බවට වර්ගීකරණය කිරීම සඳහා අපගේ අධ්‍යයනය පළමු සෘජු in vivo සාක්ෂි සපයයි.
යුකැරියෝටික් සෛලවල, එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් (ER) හි සංස්ලේෂණය කරන ලද ප්‍රෝටීන, ඒවායේ සුදුසු සෛලීය ගමනාන්තයට බෙදා හැරීම සඳහා ස්‍රාවය මාර්ගය හරහා ප්‍රවාහනය අතරතුර වර්ග කරනු ලැබේ (1). කබාය-මැදිහත් වූ වර්ග කිරීමට අමතරව, ඇතැම් ලිපිඩ නිශ්චිත ප්‍රෝටීන (2-5) තුළට පොකුරු කිරීමෙන් තෝරාගත් පිටවීමේ ස්ථාන ලෙසද සේවය කළ හැකි බව දිගු කලක් තිස්සේ අනුමාන කරන ලදී. කෙසේ වෙතත්, මෙම විය හැකි ලිපිඩ-පාදක යාන්ත්‍රණය සනාථ කිරීම සඳහා සෘජු සජීවී සාක්ෂි තවමත් නොමැත. මෙම මූලික ගැටළුව විසඳීම සඳහා, ග්ලයිකොසයිල්ෆොස්ෆැටිඩිලිනොසිටෝල් (GPI) නැංගුරම් දැමූ ප්‍රෝටීන (GPI-APs) ER වලින් වෙනස් ලෙස අපනයනය කරන ආකාරය අපි යීස්ට් තුළ අධ්‍යයනය කළෙමු. GPI-APs යනු ලිපිඩ-සම්බන්ධිත සෛල මතුපිට ප්‍රෝටීන වර්ගයකි (6, 7). GPI-AP යනු ග්ලයිකොලිපිඩ් කොටස (GPI නැංගුරම) හරහා ප්ලාස්මා පටලයේ පිටත පත්‍රිකා වලට සම්බන්ධ කර ඇති ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීනයකි. ඔවුන් GPI නැංගුරම් ER ලුමෙන් හි ගතානුගතික පශ්චාත්-පරිවර්තන වෙනස් කිරීම් ලෙස පිළිගනී (8). ඇමිණීමෙන් පසු, GPI-AP ගොල්ගි උපකරණය හරහා (5, 9) ER සිට ප්ලාස්මා පටලය දක්වා ගමන් කරයි. GPI නැංගුරම් තිබීම නිසා GPI-AP ස්‍රාවය වන මාර්ගය ඔස්සේ ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ස්‍රාවය කරන ප්‍රෝටීන වලින් (අනෙකුත් ප්ලාස්මා පටල ප්‍රෝටීන ඇතුළුව) වෙන වෙනම ප්‍රවාහනය වේ (5, 9, 10). යීස්ට් සෛල තුළ, GPI-APs එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් හි අනෙකුත් ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීන වලින් වෙන් කර, පසුව කබා ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණය II (COPII) මගින් ඔතා ඇති අද්විතීය වෙසිලි වලට ඇසුරුම් කරනු ලැබේ (6, 7). ER අපනයන ක්‍රියාවලියේ මෙම වර්ගීකරණ ක්‍රියාවලියේ නිර්ණායක අපැහැදිලි ය, නමුත් මෙම යාන්ත්‍රණයට ලිපිඩ අවශ්‍ය විය හැකි බව අනුමාන කෙරේ, විශේෂයෙන් GPI නැංගුරමේ ලිපිඩ කොටසෙහි ව්‍යුහාත්මක ප්‍රතිනිර්මාණය (5, 8). යීස්ට් වලදී, GPI ලිපිඩ ප්‍රතිනිර්මාණය GPI ඇමිණීමෙන් පසු වහාම ආරම්භ වන අතර, බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී, එය සෙරමිඩ් 26-කාබන් දිගු දාම සංතෘප්ත මේද අම්ලයට (C26:0) බන්ධනය වීමට හේතු වේ (11, 12). C26 සෙරමිඩ් යනු මෙතෙක් යීස්ට් සෛල මගින් නිපදවන ප්‍රධාන සෙරමිඩයයි. එය ER තුළ සංස්ලේෂණය කර ඇති අතර එයින් වැඩි ප්‍රමාණයක් COPII වෙසිලි හරහා ගොල්ගි උපකරණයට අපනයනය කෙරේ (13). GPI-AP හි ER අපනයනය සඳහා විශේෂයෙන් අඛණ්ඩ සෙරමිඩ සංස්ලේෂණය අවශ්‍ය වේ (14, 15), සහ අනෙක් අතට, ගොල්ගි උපකරණයේ සෙරමිඩ ඉනොසිටෝල් පොස්පේට් සෙරමිඩ (IPC) බවට පරිවර්තනය කිරීම GPI නැංගුරම් සංස්ලේෂණය මත රඳා පවතී (16). කෘතිම පටල සහිත ජෛව භෞතික අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ඉතා දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩ අද්විතීය භෞතික ගුණාංග සහිත ඇණවුම් කළ වසම් සෑදීමට ඒකාබද්ධ විය හැකි බවයි (17, 18). මෙම දත්ත C26 සෙරමිඩ සහ GPI-AP C26 සෙරමිඩ සමඟ සාපේක්ෂව අවුල් සහගත ER පටල ලිපිඩ පරිසරයේ පිළිවෙලට කලාප හෝ කලාපවලට ඒකාබද්ධ වීමට ඔවුන්ගේ භෞතික ගුණාංග භාවිතා කරන බවට උපකල්පනයට මග පාදයි. එය ප්‍රධාන වශයෙන් කෙටි සහ අසංතෘප්ත ග්ලිසරොලිපිඩ් වලින් සමන්විත වේ (C16:1 සහ C18:1) (19, 20). මෙම කලාප විශේෂිත ER පිටවීමේ ස්ථාන (ERES) කෙරෙහි තෝරා බේරා අවධානය යොමු කරනු ලබන අතර, එහිදී සෙරමිඩ් සහ සෙරමිඩ් මත පදනම් වූ GPI-AP එකම කැපවූ COPII වෙසිකලය තුළ ගොල්ගි වෙත සම-ප්‍රවාහනය කළ හැකිය (5).
මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි සුපිරි-විභේදන කොන්ෆෝකල් තත්‍ය කාලීන රූපකරණ අන්වීක්ෂය (SCLIM) භාවිතා කරමින් මෙම ලිපිඩ පාදක යාන්ත්‍රණය සෘජුවම පරීක්ෂා කර ඇත්තෙමු, එය ප්‍රතිදීප්ත ලෙස ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීන එකවර නිරීක්ෂණය කළ හැකි අති නවීන අන්වීක්ෂීය තාක්‍ෂණයකි. ත්‍රි-වර්ණ සහ ත්‍රිමාණ (3D) රූප ජීව සෛල තුළ අතිශයින් ඉහළ විභේදනයක් සහ වේගයක් ඇත (21, 22).
S. cerevisiae හි ER හැර ගිය පසු, Transmembrane ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීන වලින් C26 සෙරමිඩ් කාණ්ඩයක් සහිත සාමාන්‍ය GPI-AP පරීක්ෂා කරන ආකාරය තවදුරටත් නිර්වචනය කිරීම සඳහා අපි මුලින්ම SCLIM තාක්ෂණය යෙදුවෙමු. ER වර්ගීකරණය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි ERES තුළට ඇතුළු වන අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද භාණ්ඩ සෘජුවම දෘශ්‍යමාන කළ හැකි ජානමය පද්ධතියක් භාවිතා කළෙමු (7, 23). භාණ්ඩ ලෙස, අපි හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) සමඟ ලේබල් කරන ලද C26 සෙරමිඩ්-පාදක GPI-AP Gas1 සහ ආසන්න අධෝරක්ත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (iRFP) සමඟ ලේබල් කරන ලද ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීන් Mid2 තෝරා ගත්තෙමු, මේ දෙකම ප්ලාස්මා පටලය ඉලක්ක කරයි (24–26). sec31-1 උෂ්ණත්ව සංවේදී විකෘතියේදී, මෙම භාණ්ඩ දෙක ගැලැක්ටෝස්-ප්‍රේරිත ප්‍රවර්ධකයක් සහ සංස්ථාපිත ERES සලකුණක් යටතේ ප්‍රකාශ වේ. අධික උෂ්ණත්වයේ දී (37°C), sec31-1 විකෘතිය COPII ප්‍රරෝහණය සහ ER අපනයනය වැළැක්වීම සඳහා COPII කබා සංරචක Sec31 හි ක්‍රියාකාරිත්වයට බලපාන බැවින්, ER හි අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද භාණ්ඩ එකතු වේ (23). අඩු උෂ්ණත්වයකට (24°C) සිසිල් කිරීමෙන් පසු, sec31-1 විකෘති සෛල ස්‍රාවය වන ප්‍රදේශයෙන් යථා තත්ත්වයට පත් වූ අතර, සමුච්චිත නව කෘතිම භාණ්ඩ ER වෙතින් අපනයනය කිරීමට පටන් ගත්තේය. CLIM දෘශ්‍යකරණයෙන් පෙන්නුම් කළේ අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද Gas1-GFP සහ Mid2-iRFP බොහොමයක් 37°C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසුව sec31-1 විකෘති සෛලවල ER හි තවමත් එකතු වී ඇති බවත් පසුව 24°C දී මිනිත්තු 5 ක් මුදා හරින බවත්ය (රූපය 1). Mid2-iRFP මුළු ER පටලය මත බෙදා හරින අතර, Gas1-GFP අඛණ්ඩ ER පටල ප්‍රදේශයේ සාන්ද්‍රණය වී රැස් කර ඇති බැවින්, ඒවායේ ව්‍යාප්තිය සම්පූර්ණයෙන්ම වෙනස් වේ (රූපය 1, A සිට C සහ Movie S1). ඊට අමතරව, රූපය 1D හි පෙන්වා ඇති පරිදි, Gas1-GFP පොකුරේ Mid2-iRFP නොමැත. මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ GPI-AP සහ ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීන කලින් විවිධ ER පටල කලාපවලට වෙන් කර ඇති බවයි. Gas1-GFP පොකුර mCherry හි COPII ආලේපන ප්‍රෝටීන් Sec13 (රූපය 1, E සහ F, සහ චිත්‍රපට S1) (23) සමඟ ලේබල් කරන ලද නිශ්චිත ERES එකකට යාබදව පිහිටා ඇත.
sec31-1 සෛල ගැලැක්ටෝස්-ප්‍රේරිත ස්‍රාවයන්, දිගු ඇසයිල් දාමයක් (C26) සෙරමිඩ් GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, කොළ) සහ ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීන් Mid2-iRFP (TMP, නිල්) ප්‍රකාශ කරන අතර මෙම නිර්මාණාත්මක ERES ලේබල් කිරීම Sec13-mCherry (ERES, මැජෙන්ටා) 37°C දී මිනිත්තු 30ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කර, 24°C වෙත ගෙන ගොස්, SCLIM විසින් මිනිත්තු 5කට පසුව රූපගත කරන ලදී. (A සිට C) දක්වා තලයක (A) නියෝජිත ඒකාබද්ධ හෝ තනි 2D රූපයක්, z-කොටස් 10ක (B) 2D ප්‍රක්ෂේපණ රූපයක් හෝ භාණ්ඩ සහ ERES සලකුණු වල 3D සෛල අර්ධගෝල රූපයක් සහ ERES සලකුණු (C) පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව 1μm (A සහ B). පරිමාණ ඒකකය 0.551μm (C) වේ. Gas1-GFP විවික්ත ER කලාපවල හෝ පොකුරු වල අනාවරණය වූ අතර, Mid2-iRFP හඳුනාගෙන ER පටලය (C) පුරා බෙදා හරින ලදී. (D) ප්‍රස්ථාරය මඟින් Gas1-GFP පොකුරේ Gas1-GFP සහ Mid2-iRFP වල සාපේක්ෂ ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය සුදු ඊතල රේඛාව (වමේ) ඔස්සේ පෙන්වයි. AU, අත්තනෝමතික ඒකකය. (E සහ F) භාණ්ඩ සහ ERES සලකුණ ඒකාබද්ධ කරන 3D රූපය නියෝජනය කරයි. නිශ්චිත ERES අසල Gas1-GFP පොකුරු අනාවරණය විය. පරිමාණ ඒකකය 0.551μm වේ. (F) සුදු ඝන ඊතලය ERES හා සම්බන්ධ Gas1-GFP පොකුර සලකුණු කරයි. මැද සහ දකුණු පැනල් ඒකාබද්ධ කරන ලද විශාල කරන ලද 3D රූපය සහ තෝරාගත් Gas1-GFP පොකුරේ භ්‍රමණය වූ දසුනක් පෙන්වයි.
Gas1-GFP පොකුරක් සහ නිශ්චිත ERES අතර ඇති සමීප අවකාශීය සම්බන්ධතාවයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ Gas1-GFP හට තෝරාගත් ERES වලට ඇතුළු විය හැකි බවයි, එය Mid2-iRFP විසින් ER හැර යාමට භාවිතා කරන තේරීමට වඩා වෙනස් වේ. මෙම හැකියාව ආමන්ත්‍රණය කිරීම සඳහා, අපි භාණ්ඩ එකක් හෝ දෙකක් සඳහා ERES අනුපාතය ප්‍රමාණනය කළෙමු (රූපය 2, A සිට C දක්වා). බොහෝ ERES (70%) හි ඇත්තේ එක් භාණ්ඩ වර්ගයක් පමණක් බව අපට පෙනී ගියේය. රූපය 2C හි පහළ රූපයේ Gas1-GFP පමණක් (රූපය 1) හෝ Mid2-iRFP පමණක් (රූපය 2) සහිත ERES හි සාමාන්‍ය උදාහරණ දෙකක් පෙන්වයි. ඊට වෙනස්ව, ආසන්න වශයෙන් ERES වලින් 20% ක් එකම ප්‍රදේශයක අතිච්ඡාදනය වන භාණ්ඩ දෙකක් අඩංගු වේ. සමහර ERES (10%) හි භාණ්ඩ වර්ග දෙකක් අඩංගු බව සොයා ගන්නා ලදී, නමුත් ඒවා පැහැදිලිවම වෙනස් ප්‍රදේශවල හුදකලා විය. එබැවින්, මෙම සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ ER අපනයනය කිරීමෙන් පසු GPI-AP Gas1-GFP සහ ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් භාණ්ඩ Mid2-iRFP විවිධ ERES වලට බෙදා ඇති බවයි (රූපය 2D). මෙම වර්ග කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව පෙර ජෛව රසායනික විශ්ලේෂණය (6) සහ රූප විද්‍යාත්මක නිර්ණය (7) සමඟ ඉතා අනුකූල වේ. ERES (රූපය 2E සහ චිත්‍රපට S2) ඇතුළු වන නිරෝධායන භාණ්ඩවල හැසිරීම ද අපට නිරීක්ෂණය කළ හැකිය. රූපය 2E හි දැක්වෙන්නේ Gas1-GFP (පැනලය 3) හෝ Mid2-iRFP (පැනලය 4) හි කුඩා කොටසක් පමණක් ERES වෙත එක් පැත්තකින් ඇතුළු වන අතර එය විවික්ත ප්‍රදේශයකට සීමා වී ඇති බවයි. රූපය 2E හි පැනලය 5 හි පෙන්නුම් කරන්නේ Gas1-GFP සහ Mid2-iRFP සමහර විට එකම ERES හි දක්නට ලැබෙන නමුත් ඒවා විවිධ පැතිවලින් ඇතුළු වන අතර විවිධ COPII වෙසිලි නියෝජනය කළ හැකි වෙනම කලාපවල සංකේන්ද්‍රණය වී ඇති බවයි. තෝරාගත් ERES ලෙස C26 සෙරමිඩ් මත පදනම් වූ GPI-AP Gas1 නිරීක්ෂණය කරන ලද වෙන් කිරීම සහ වර්ගීකරණය නිශ්චිත බව අපි තහවුරු කළෙමු, මන්ද තවත් ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ස්‍රාවය කරන භාණ්ඩයක් වන GFP-ටැග් කළ ප්ලාස්මා පටල ප්‍රෝටීන් Axl2 (27), Mid2-iRFP ට සමාන හැසිරීමක් පෙන්වයි. (පින්තූරය S1 සහ චිත්‍රපට S3). අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද Axl2-GFP, Mid2-iRFP (රූපය S1, A සහ ​​B) වැනි ER පටලය හරහා බෙදා හරින අතර, බොහෝ ERES වල Mid2-iRFP සමඟ සම-ස්ථානගත කර ඇත (රූපය S1, B සිට D දක්වා). රූපය 1 හි පැනල් 1 සහ 2. S1C මඟින් ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් භාණ්ඩ දෙකක් අතිච්ඡාදනය වන ERES හි සාමාන්‍ය උදාහරණ දෙකක් පෙන්වයි. මෙම අවස්ථා වලදී, භාණ්ඩ දෙකම එකට ERES වලට ඇතුල් වේ (රූපය S1E, පැනලය 3 සහ චිත්‍රපට S3).
ගැලැක්ටෝස් ප්‍රේරිත ස්‍රාවයන් ප්‍රකාශ කරන sec31-1 සෛල, Gas1-GFP (GPI-AP, කොළ) සහ Mid2-iRFP (TMP, නිල්) සහ Sec13-mCherry (ERES, මැජෙන්ටා) ලේබල් කරන ලද sec31-1 සෛල 37 හි තැන්පත් කරන ලදී. °C දී මිනිත්තු 30 ක් ඉන්කියුබේට් කිරීමෙන් පසු, ස්‍රාවය බ්ලොක් එක මුදා හැරීමට 24 °C වෙත ගෙන ගොස්, මිනිත්තු 20 කට පසු SCLIM සමඟ රූපය. (A සිට C) භාණ්ඩයේ නියෝජිත 2D ප්‍රක්ෂේපණ රූප (A; පරිමාණ තීරුව, 1μm) හෝ 3D සෛල අර්ධගෝල රූප (B සහ C; පරිමාණ ඒකකය, 0.456μm) සහ ERES මගින් සලකුණු කරන ලද 10 z-කොටස්. (B) හි පහළ පුවරුව සහ (C) හි පුවරුව ERES (මැජෙන්ටා) හි ඇති භාණ්ඩ පමණක් පෙන්වීමට සැකසූ රූප පෙන්වයි [Gas1-GFP (අළු) සහ Mid2-iRFP (ලා නිල්)]. (C) විවෘත ඊතලය: ERES රැගෙන යන්නේ එක් භාණ්ඩ කැබැල්ලක් පමණි (1 සිට 4 දක්වා). අළු ඊතලය: ERES හි වෙන් කරන ලද භාණ්ඩ අඩංගු වේ (5). සුදු ඝන ඊතලය: සම-ස්ථානගත භාණ්ඩ අඩංගු ERES. පහත: තෝරාගත් තනි ERES හි Gas1-GFP (1) හෝ Mid2-iRFP (2) පමණක් අඩංගු වේ. පරිමාණ තීරුව, 100 nm. (D) (C) හි විස්තර කර ඇති ෆොටෝමයික්‍රොග්‍රැෆ් ප්‍රමාණනය කිරීම. එක් භාණ්ඩයක් පමණක් අඩංගු ERES හි සාමාන්‍ය ප්‍රතිශතය (Gas1-GFP හෝ Mid2-iRFP), වෙන් කරන ලද භාණ්ඩ සහ අතිච්ඡාදනය වන භාණ්ඩ. ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකදී, සෛල 54 කින් n=432. දෝෂ තීරුව = SD. ද්විත්ව වලිග යුගල නොකළ t පරීක්ෂණය. *** P = 0.0002. (E) (C) ලෙස සලකුණු කර ඇති නිරෝධායන භාණ්ඩවල තෝරාගත් ERES හි 3D රූපය. Gas1-GFP (කොළ) (3) හෝ Mid2-iRFP (නිල්) (4) එක් පැත්තකින් ERES (මැජෙන්ටා) වෙත ඇතුළු වන අතර ERES තුළ කුඩා ප්‍රදේශයකට සීමා වේ. සමහර විට, භාණ්ඩ වර්ග දෙකම එකම පැත්තෙන් එකම ERES (5) වෙත ඇතුළු වන අතර ERES තුළ හුදකලා ප්‍රදේශයකට සීමා වේ. පරිමාණ තීරුව, 100 nm.
ඊළඟට, ER පටලයේ පවතින දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩ් (C26) මගින් Gas1 හි නිශ්චිත පොකුරුකරණය සහ වර්ග කිරීම තෝරාගත් ERES බවට පත් කරන බවට උපකල්පනයක් අපි පරීක්ෂා කළෙමු. මේ සඳහා, අපි නවීකරණය කරන ලද යීස්ට් වික්‍රියා GhLag1 භාවිතා කළ අතර, එහි දී ආවේණික සෙරමිඩ් සංස්ලේෂක දෙක Lag1 සහ Lac1 GhLag1 (කපු වල Lag1 සමජාතීය) මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස වල් වර්ගයට වඩා කෙටි සෛල පටලයක් සහිත සෙරමිඩ් වික්‍රියාවක් ඇති විය (රූපය 3A) (28). ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂමිතික (MS) විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ වල් වර්ගයේ වික්‍රියා වල, මුළු සෙරමිඩයෙන් 95% ක් ඉතා දිගු (C26) දාම සෙරමිඩ වන අතර, GhLag1 හි, සෙරමිඩයෙන් 85% ක් ඉතා දිගු (C18 සහ C16) බවයි. ), සෙරමිඩ වලින් 2% ක් පමණක් ඉතා දිගු (C26) දාම සෙරමිඩ වේ. GhLag1 පටලයේ මෙතෙක් අනාවරණය වී ඇති ප්‍රධාන සෙරමිඩ C18 සහ C16 සෙරමිඩ වුවද, MS විශ්ලේෂණයෙන් තහවුරු වූයේ GhLag1 වික්‍රියාවේ ප්‍රකාශිත Gas1-GFP හි GPI නැංගුරමේ C26 සෙරමිඩ අඩංගු වන අතර එය වල් වර්ගයේ ලිපිඩ සමඟ සැසඳිය හැකි බවයි. ගුණාත්මකභාවය සමාන වේ (රූපය 3A) (26). එබැවින්, මෙයින් අදහස් කරන්නේ සෙරමිඩ ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේ එන්සයිමය Cwh43 C26 සෙරමිඩ සඳහා බෙහෙවින් තෝරා ගන්නා බවයි, රූපය 26 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, එය GhLag1 වික්‍රියාවේ C26 සෙරමිඩ කුඩා ප්‍රමාණයකින් GPI නැංගුරම වඩාත් කැමති ලෙස ඇතුළත් කරයි. S2 (29). කෙසේ වෙතත්, GhLag1 හි සෛල පටලයේ මූලික වශයෙන් C18-C16 සෙරමිඩ පමණක් අඩංගු වන අතර, Gas1-GFP හි තවමත් C26 සෙරමිඩ ඇත. මෙම කරුණ මෙම වික්‍රියාව ER හි පටල සෙරමිඩයේ ඇසයිල් දාම දිග පිළිබඳ ගැටළුව විශේෂයෙන් විසඳීමට කදිම මෙවලමක් බවට පත් කරයි. පන්තියේ සහ වර්ග කිරීමේ උපකල්පිත භූමිකාව. ඉන්පසුව, අපි මුලින්ම සාම්ප්‍රදායික ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය හරහා sec31-1 උෂ්ණත්ව සංවේදී විකෘති ඇලිලයක් සහිත GhLag1 හි පොකුරු වල C26 Gas1-GFP සමුච්චය වීමේ හැකියාව අධ්‍යයනය කළෙමු, එහිදී දිගු (C18-C16) දාමය පමණක් ER පටල සෙරමිඩ් තුළ පවතී (රූපය 3). sec31-1 දී, Gas1-GFP වලින් වැඩි ප්‍රමාණයක් පොකුරු වල සංකේන්ද්‍රණය වී ඇති බව අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර, sec31-1 දී දිගු (C18-C16) දිගු සෙරමිඩ් ER පටලයක් සහිත Gas1-GFP GhLag1 ප්‍රධාන වශයෙන් පොකුරු කර බෙදා හැර නොමැති බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. හරියටම කිවහොත්, C26 සෙරමිඩ් මත පදනම් වූ පොකුරු කිරීම නිශ්චිත ERES සමඟ සමීපව සම්බන්ධ වන නිසා (රූපය 1), මෙම ක්‍රියාවලියට ER අපනයන ප්‍රෝටීන් යාන්ත්‍රණයේ ක්‍රියාකාරිත්වය ද ඇතුළත් විය හැකිද යන්න අපි ඊළඟට විමර්ශනය කළෙමු. GPI-AP ER අපනයනය සඳහා විශේෂ COPII පද්ධතියක් භාවිතා කරයි, එය GPI නැංගුරමේ ග්ලයිකන් කොටසෙහි Ted1 හි ව්‍යුහාත්මක ප්‍රතිනිර්මාණය මගින් ක්‍රියාකාරීව නියාමනය කරනු ලැබේ (30, 31). ප්‍රතිසංයෝජක GPI-glycan පසුව ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් භාණ්ඩ ප්‍රතිග්‍රාහක p24 සංකීර්ණය මගින් හඳුනා ගනු ලබන අතර, එය ප්‍රධාන COPII භාණ්ඩ බන්ධන උප ඒකකයක් වන Sec24 හි නිශ්චිත සමස්ථානිකයක් වන Lst1 තෝරා බේරා බඳවා ගන්නා අතර, GPI-AP-පොහොසත් COPII වෙසිලි අවශ්‍ය වේ (31-33). එබැවින්, අපි මෙම තනි ප්‍රෝටීන (p24 සංකීර්ණ සංරචකය Emp24, GPI-glycan ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේ එන්සයිම Ted1 සහ නිශ්චිත COPII උප ඒකකය Lst1) මකා දැමීම sec31-1 විකෘති වික්‍රියාව සමඟ ඒකාබද්ධ කරන ද්විත්ව විකෘතියක් ගොඩනඟා, ඒවා අධ්‍යයනය කළෙමු. Gas1-cluster GFP සෑදීමට හැකිද (රූපය 3). sec31-1emp24Δ සහ sec31-1ted1Δ හි, Gas1-GFP ප්‍රධාන වශයෙන් පොකුරු රහිතව ER පටලය පුරා බෙදා හරින බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, කලින් sec31-1 GhLag1 හි දක්නට ලැබුණු පරිදි, sec31-1lst1Δ හි, Gas1-GFP sec31-1 මෙන්. මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ ER පටලයේ C26 සෙරමිඩ් පැවතීමට අමතරව, Gas1-GFP පොකුරු කිරීම p24 සංකීර්ණයට බැඳිය යුතු බවත්, නිශ්චිත Lst1 බඳවා ගැනීමක් අවශ්‍ය නොවන බවත්ය. ඉන්පසුව, ER පටලයේ ඇති සෙරමිඩ් දාම දිගට Gas1-GFP p24 වෙත බන්ධනය නියාමනය කළ හැකි බවට ඇති හැකියාව අපි ගවේෂණය කළෙමු. කෙසේ වෙතත්, පටලයේ C18-C16 සෙරමිඩ් පැවතීම p24 සංකීර්ණය මගින් ප්‍රතිනිර්මාණය කරන ලද GPI-ග්ලයිකන් වලට බලපාන්නේ නැති බව අපට පෙනී ගියේය (රූප S3 සහ S4, A සහ ​​B) හෝ GPI-AP වෙත බන්ධනය වී GPI-AP අපනයනය කිරීමේ හැකියාව. බඳවා ගන්න COPII උප වර්ගය Lst1 (රූපය S4C). එබැවින්, C26 සෙරමිඩ් මත යැපෙන පොකුරු කිරීම සඳහා විවිධ ER අපනයන ප්‍රෝටීන් යාන්ත්‍රණ සමඟ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා අවශ්‍ය නොවන නමුත් ලිපිඩ දිග මගින් මෙහෙයවනු ලබන විකල්ප වර්ග කිරීමේ යාන්ත්‍රණයකට සහාය වේ. ඉන්පසුව, ER පටලයේ ඇති සෙරමිඩ් ඇසයිල් දාම දිග Gas1-GFP තෝරාගත් ERES ලෙස ඵලදායී ලෙස වර්ගීකරණය කිරීම සඳහා වැදගත් දැයි අපි විශ්ලේෂණය කළෙමු. කෙටි දාම සෙරමිඩ් සහිත GhLag1 වික්‍රියාවේ Gas1, ER හැර ගොස් ප්ලාස්මා පටලයට ඇතුළු වන බැවින් (රූපය S5), සෙරමිඩ් ඇසයිල් දාමයේ දිග අනුව වර්ග කිරීම සිදු කළහොත්, GhLag1 වික්‍රියාවේ Gas1 නැවත හරවා යැවිය හැකි බව අපි විශ්වාස කරමු. එකම පටලයක් සහිත ERES භාණ්ඩ.
(A) GhLag1 හි සෛල පටලයේ ප්‍රධාන වශයෙන් කෙටි C18-C16 සෙරමිඩ අඩංගු වන අතර, Gas1-GFP හි GPI නැංගුරමේ තවමත් වල් වර්ගයේ සෛල වලට සමාන C26 IPC ඇත. ඉහත: ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (MS) මගින් වල් වර්ගයේ (Wt) සහ GhLag1p වික්‍රියා වල සෛල පටලයේ සෙරමිඩයේ ඇසයිල් දාම දිග විශ්ලේෂණය. දත්ත මුළු සෙරමිඩයේ ප්‍රතිශතය නියෝජනය කරයි. ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනක සාමාන්‍යය. දෝෂ තීරුව = SD. ද්වි-වලිග යුගල නොකළ t පරීක්ෂණය. **** P ＜0.0001. පහළ පුවරුව: වල් වර්ගයේ සහ GhLag1p වික්‍රියා වල ප්‍රකාශිත Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI නැංගුරමේ පවතින IPC හි ඇසයිල් දාම දිග පිළිබඳ MS විශ්ලේෂණය. දත්ත මුළු IPC සංඥාවේ ප්‍රතිශතය නියෝජනය කරයි. ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් පහක සාමාන්‍යය. දෝෂ තීරුව = SD. ද්වි-වලිග නොකළ t පරීක්ෂණය. ns, වැදගත් නොවේ. P = 0.9134. (B) ගැලැක්ටෝස්-ප්‍රේරිත Gas1-GFP ප්‍රකාශ කරන sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ සහ sec31-1lst1Δ සෛලවල ප්‍රතිදීප්ත ක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆි 37°C දී මිනිත්තු 30ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කර 24°C පසු සාමාන්‍ය ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂයක් සිදු කිරීමට සම්ප්‍රේෂණය කරන ලදී. සුදු ඊතලය: ER Gas1-GFP පොකුර. විවෘත ඊතලය: පොකුරු නොකළ Gas1-GFP මුළු ER පටලය මත බෙදා හරින අතර, ER ලක්ෂණ සහිත න්‍යෂ්ටික වළලු පැල්ලම් පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව, 5μm. (C) (B) හි විස්තර කර ඇති ෆොටෝක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆියේ ප්‍රමාණනය. සිදුරු සහිත Gas1-GFP ව්‍යුහය සහිත සෛලවල සාමාන්‍ය ප්‍රතිශතය. ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකදී, n≥300 සෛල. දෝෂ තීරුව = SD. වලිග රහිත යුගල නොකළ t පරීක්ෂණය. **** P ＜0.0001.
මෙම ගැටළුව සෘජුවම විසඳීම සඳහා, අපි sec31-1 උෂ්ණත්ව සංවේදී විකෘති ඇලිලය (රූපය 4 සහ චිත්‍රපට S4) සමඟ GhLag1 හි Gas1-GFP සහ Mid2-iRFP හි SCLIM දෘශ්‍යකරණය සිදු කළෙමු. ER 37°C දී රඳවා තබා පසුව 24°C දී මුදා හැරීමෙන් පසුව, සාම්ප්‍රදායික අන්වීක්ෂ මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලද පරිදි, අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද Gas1-GFP බොහොමයක් පොකුරු කර ER පටලය පුරා බෙදා හරිනු නොලැබුණි (රූපය 4, A සහ ​​B). ඊට අමතරව, ERES හි විශාල ප්‍රතිශතයකට (67%) එහි සම-ස්ථානගත කර ඇති භාණ්ඩ වර්ග දෙකක් ඇතුළත් වේ (රූපය 4D). රූපය 4C හි පැනල් 1 සහ 2 අතිච්ඡාදනය වන Gas1-GFP සහ Mid2-GFP සහිත ERES හි සාමාන්‍ය උදාහරණ දෙකක් පෙන්වයි. ඊට අමතරව, භාණ්ඩ දෙකම එකම ERES වෙත බඳවා ගන්නා ලදී (රූපය 4E, පැනලය 3 සහ චිත්‍රපට S4). එබැවින්, අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ ER පටලයේ ඇති සෙරමිඩ් ඇසයිල් දාමයේ දිග ER ප්‍රෝටීන් එකතු කිරීම සහ වර්ගීකරණය සඳහා වැදගත් නිර්ණායකයක් බවයි.
ගැලැක්ටෝස්-ප්‍රේරිත ස්‍රාවයන් ප්‍රකාශ කරන Sec31-1 GhLag1 සෛල, Gas1-GFP (GPI-AP, කොළ) සහ Mid2-iRFP (TMP, නිල්) සහ ව්‍යුහාත්මක ERES-ලේබල් කරන ලද Sec13-mCherry (ERES, මැජෙන්ටා) 37°C දී ඉන්කියුබේට් කරන්න. මිනිත්තු 30ක් දිගටම කරගෙන යන්න, ස්‍රාවයන් මුදා හැරීමට 24°C දක්වා පහත හෙළන්න, සහ මිනිත්තු 20කට පසු SCLIM සමඟ රූපය. (A සිට C) භාණ්ඩ සහ ERES මගින් සලකුණු කරන ලද 10 z-කොටස් වල නියෝජිත 2D ප්‍රක්ෂේපණ රූප (A; පරිමාණ තීරුව, 1μm) හෝ 3D සෛල අර්ධගෝල රූප (B සහ C; පරිමාණ ඒකකය, 0.45μm). (B) හි පහළ පුවරුව සහ (C) හි පුවරුව ERES (මැජෙන්ටා) හි ඇති භාණ්ඩ පමණක් පෙන්වීමට සැකසූ රූප පෙන්වයි [Gas1-GFP (අළු) සහ Mid2-iRFP (ලා නිල්)]. (C) සුදු පිරවූ ඊතලය: ERES, භාණ්ඩ අතිච්ඡාදනය වේ. විවෘත ඊතලය: ERES හි ඇත්තේ එක් අයිතමයක් පමණි. පහළ පුවරුව: තෝරාගත් ERES හි (C) හි සලකුණු කර ඇති අතිච්ඡාදනය වන භාණ්ඩ (1 සහ 2) ඇත. පරිමාණ තීරුව, 100 nm. (D) (C) හි විස්තර කර ඇති ෆොටෝමයික්‍රොග්‍රැෆ් ප්‍රමාණනය. sec31-1 සහ sec31-1 GhLag1 ඒකකවල, එක් භාණ්ඩයක් (Gas1-GFP හෝ Mid2-iRFP) පමණක් ඇතුළත් කර ඇති අතර, හුදකලා භාණ්ඩ සහ අතිච්ඡාදනය වන භාණ්ඩ සඳහා ERES හි සාමාන්‍ය ප්‍රතිශතය. ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකදී, සෛල 54 කින් n = 432 (sec31-1) සහ සෛල 47 කින් n = 430 (sec31-1 GhLag1). දෝෂ තීරුව = SD. වලිග දෙකකින් යුගල නොකළ t පරීක්ෂණය. *** P = 0.0002 (sec31-1) සහ ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C) හි සලකුණු කර ඇති අතිච්ඡාදනය වන භාණ්ඩ (3) සහිත තෝරාගත් ERES හි 3D රූපය. Gas1-GFP (කොළ) සහ Mid2-iRFP (නිල්) එකම පැත්තේ සිට ERES (මැජෙන්ටා) වෙත ළඟා වී එකම ERES සීමා සහිත ප්‍රදේශයේ රැඳී සිටින්න. පරිමාණ තීරුව, 100 nm.
මෙම අධ්‍යයනයෙන් ලිපිඩ මත පදනම් වූ ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ ස්‍රාවය කරන මාර්ගයේ තෝරාගත් අපනයන ස්ථාන ලෙස වර්ගීකරණය කර ඇති බවට සෘජු සජීවී සාක්ෂි සපයන අතර, වර්ගීකරණ තේරීම සඳහා ඇසයිල් දාම දිගේ වැදගත්කම හෙළි කරයි. SCLIM ලෙස හඳුන්වන බලගතු සහ අති නවීන අන්වීක්ෂීය තාක්‍ෂණයක් භාවිතා කරමින්, අපි යීස්ට් වල අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද Gas1-GFP (ඉතා දිගු ඇසයිල් දාමයක් (C26) සෙරමිඩ් ලිපිඩ කොටසක් සහිත ප්‍රධාන ප්ලාස්මා පටල GPI-AP) නිරූපණය කළෙමු. විවික්ත ER වල පොකුරු කර ඇති කලාප නිශ්චිත ERES සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති අතර, ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීන ER පටලය පුරා බෙදා හරිනු ලැබේ (රූපය 1). ඊට අමතරව, මෙම භාණ්ඩ වර්ග දෙක විවිධ ERES වලට තෝරා බේරා ඇතුළත් වේ (රූපය 2). පටලයේ ඇති සෛලීය සෙරමිඩයේ ඇසයිල් දාම දිග C26 සිට C18-C16 දක්වා අඩු වේ, Gas1-GFP පොකුර විවික්ත ER කලාපයට බාධා ඇති වේ, සහ Gas1-GFP එකම ERES හරහා ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීනය සමඟ ER වලින් පිටවීමට නැවත හරවා යවනු ලැබේ (රූපය 3 සහ රූපය 3). 4).
ER වලින් පිටවීම සඳහා GPI-AP විශේෂිත ප්‍රෝටීන් යාන්ත්‍රණයක් භාවිතා කළද, C26 සෙරමිඩ් මත යැපෙන වෙන්වීම ERES විශේෂීකරණයට හේතු විය හැකි අවකල ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා මත රඳා නොපවතින බව අපට පෙනී ගියේය (රූප S4 සහ S5). ඒ වෙනුවට, අපගේ සොයාගැනීම් ලිපිඩ මත පදනම් වූ ප්‍රෝටීන් පොකුරු කිරීම සහ අනෙකුත් භාණ්ඩ පසුව බැහැර කිරීම මගින් මෙහෙයවනු ලබන විකල්ප වර්ගීකරණ යාන්ත්‍රණයකට සහාය දක්වයි. අපගේ නිරීක්ෂණවලින් පෙනී යන්නේ නිශ්චිත ERES සමඟ සම්බන්ධ වූ Gas1-GFP කලාපයේ හෝ පොකුරේ ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීන් Mid2-iRFP නොමැති බවයි, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ C26 සෙරමිඩ් මත යැපෙන GPI-AP පොකුර අදාළ ERES වෙත ඇතුළු වීමට පහසුකම් සපයන අතර ඒ සමඟම, ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් බැහැර කරයි. ස්‍රාවයන් මෙම විශේෂිත ERES වෙත ඇතුළු වේ (රූප 1 සහ 2). ඊට වෙනස්ව, ER පටලයේ C18-C16 සෙරමිඩ තිබීම GPI-AP කලාප හෝ පොකුරු සෑදීමට හේතු නොවේ, එබැවින් ඒවා ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ස්‍රාවය කරන ලද ප්‍රෝටීන එකම ERES බවට බැහැර කිරීම හෝ ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීම සිදු නොකරයි (රූප 3 සහ 4). . එබැවින්, නිශ්චිත ERES සමඟ සම්බන්ධ වූ ප්‍රෝටීන පොකුරු කිරීම පහසු කිරීම මගින් C26 සෙරමිඩ් වෙන් කිරීම සහ වර්ගීකරණය මෙහෙයවන බව අපි යෝජනා කරමු.
මෙම C26 සෙරමිඩ් මත යැපෙන පොකුරු කිරීම නිශ්චිත ER ප්‍රදේශයකට සාක්ෂාත් කරගන්නේ කෙසේද? පටල සෙරමිඩ් පාර්ශ්වීයව වෙන් වීමේ ප්‍රවණතාවය GPI-AP සහ C26 සෙරමිඩ් කෙටි හා අසංතෘප්ත ග්ලිසරොලිපිඩ් අඩංගු ER පටලයේ වඩාත් අක්‍රමවත් ලිපිඩ පරිසරය තුළ කුඩා හා ක්ෂණිකව ඇණවුම් කරන ලද ලිපිඩ සෑදීමට හේතු විය හැක. ගුණාත්මක පොකුරු (17, 18). මෙම කුඩා තාවකාලික පොකුරු p24 සංකීර්ණයට බන්ධනය වීමෙන් පසු විශාල, වඩාත් ස්ථායී පොකුරු වලට තවදුරටත් ඒකාබද්ධ කළ හැකිය (34). මෙයට අනුකූලව, විශාල දෘශ්‍ය පොකුරු සෑදීමට C26 Gas1-GFP p24 සංකීර්ණය සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කළ යුතු බව අපි පෙන්වා දුන්නෙමු (රූපය 3). p24 සංකීර්ණය යනු යීස්ට් වල විවිධ p24 ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීන හතරකින් සමන්විත විෂමජාතීය ඔලිගෝමරයකි (35), එය බහුසංයුජ බන්ධනයක් සපයයි, එය කුඩා GPI-AP පොකුරු හරස් සම්බන්ධ කිරීමට හේතු විය හැකි අතර එමඟින් විශාල ස්ථායී පොකුරු ජනනය කරයි (34). GPI-AP වල ප්‍රෝටීන් එක්ටෝඩොමේන් අතර අන්තර්ක්‍රියා ද ඒවායේ එකතු වීමට දායක විය හැකි අතර, ක්ෂීරපායී ධ්‍රැවීකරණය වූ එපිටිලියල් සෛලවල ගොල්ගි ප්‍රවාහනයේදී පෙන්නුම් කරන පරිදි (36). කෙසේ වෙතත්, C18-C16 සෙරමිඩ් ER පටලයේ පවතින විට, p24 සංකීර්ණය Gas1-GFP සමඟ බන්ධනය වන විට, විශාල වෙනම පොකුරු සෑදෙන්නේ නැත. යටින් පවතින යාන්ත්‍රණය දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩවල නිශ්චිත භෞතික හා රසායනික ගුණාංග මත රඳා පවතී. කෘතිම පටලවල ජෛව භෞතික අධ්‍යයනවලින් පෙනී යන්නේ දිගු (C24) සහ කෙටි (C18-C16) ඇසයිල් දාම සෙරමිඩ දෙකම අදියර වෙන් කිරීමට හේතු විය හැකි නමුත්, දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩ (C24) පමණක් ඉහළ වක්‍රය සහ පටල නැමීම ප්‍රවර්ධනය කළ හැක්කේ පටලය නැවත හැඩගැස්වීම සඳහා බවයි. අන්‍යෝන්‍ය යොමුව හරහා (17, 37, 38). Emp24 හි මානව සමජාතීයතාවය වන TMED2 හි ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් හෙලික්ස්, සයිටොප්ලාස්මික් ලොබියුල්ස් වල C18 සෙරමිඩ් මත පදනම් වූ ස්පින්ගෝමයිලින් සමඟ වරණාත්මකව අන්තර්ක්‍රියා කරන බව පෙන්වා දී ඇත (39). අණුක ගතික (MD) සමාකරණ භාවිතා කරමින්, C18 සහ C26 සෙරමිඩ දෙකම Emp24 ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් හෙලික්ස් හි සයිටොප්ලාස්මික් ලොබියුල්ස් වටා එකතු වන බවත්, ඒවාට සමාන මනාපයන් ඇති බවත් අපට පෙනී ගියේය (රූපය S6). Emp24 හි ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් හෙලික්ස් පටලයේ ලිපිඩ අසමමිතික ව්‍යාප්තියට හේතු විය හැකි බව මෙයින් ඇඟවෙන බව සඳහන් කිරීම වටී. මෙය ක්ෂීරපායී සෛල මත පදනම් වූ මෑත කාලීන ප්‍රතිඵලයකි. සමාන MD සමාකරණ මගින් ඊතර් ලිපිඩ තිබීම ද පෙන්නුම් කරයි (40). එබැවින්, ER26 හි ලොබියුල්ස් දෙකෙහි C26 සෙරමිඩ් දේශීයව පොහොසත් වී ඇති බව අපි අනුමාන කරමු. ලුමිනල් ලොබියුලස් වල GPI-AP සෘජුවම බහුසංයුජ p24 සමඟ බන්ධනය වන විට සහ සයිටොප්ලාස්මික් ලොබියුලස් වල p24 වටා C26 සෙරමිඩ් සමුච්චය වන විට, එය සමඟ ඇති ප්‍රෝටීන් සමුච්චය ප්‍රවර්ධනය කළ හැකි අතර පටල වක්‍රය ඇඟිලි හරහා ජනනය වේ (41), GPI-AP ERES වලට යාබදව විවික්ත කලාපවලට වෙන් වීමට හේතු වන අතර එය ER පටලයේ ඉහළ වක්‍ර කලාපවලටද හිතකර වේ (42). පෙර වාර්තා යෝජිත යාන්ත්‍රණයට සහාය විය (43, 44). ප්ලාස්මා පටලය මත ඔලිගොලෙක්ටින්, රෝග කාරක හෝ සෙරමිඩ් මත පදනම් වූ ග්ලයිකොස්ෆින්ගොලිපිඩ් (GSL) වලට ප්‍රතිදේහ බහුසංයුජ බන්ධනය විශාල GSL සමුච්චය අවුලුවයි, අදියර වෙන් කිරීම වැඩි දියුණු කරන අතර පටල විරූපණය සහ අභ්‍යන්තරකරණය ඇති කරයි (44). ඉවාබුචි ආදිය (43) දිගු (C24) නමුත් කෙටි නොවන (C16) ඇසයිල් දාම ඉදිරියේ, GSL ලැක්ටොසිල්සෙරමයිඩ් වලට බැඳී ඇති බහුසංයුජ ලිගන්ඩ් විශාල පොකුරු සෑදීමට සහ පටල ආක්‍රමණයට හේතු වූ බව සොයා ගන්නා ලදී, සහ පත්‍රිකා මත සයිටොප්ලාස්මය Lyn-මැදිහත් වූ සංඥා සම්ප්‍රේෂණය යුගලනය කරන ලද නියුට්‍රොෆිල්වල ඇසයිල් දාම මගින් අන්තර් සංඛ්‍යාංකනය කර ඇත.
ක්ෂීරපායී ධ්‍රැවීකරණය වූ එපිටිලියල් සෛලවල, ප්‍රති-ගොල්ගි ජාලයේ (TGN) සාන්ද්‍රණය අග්‍ර ප්ලාස්මා පටලයේ මට්ටමට GPI-AP වෙන් කිරීම සහ වර්ග කිරීම පාලනය කරයි (10, 45). මෙම එකතු කිරීම GPI-AP ඔලිගෝමරීකරණය මගින් මෙහෙයවනු ලැබේ (36), නමුත් එය යීස්ට් වල අප සොයා ගන්නා සෙරමිඩ් දාමයේ දිග මත ද රඳා පවතී. ක්ෂීරපායී GPI-AP හි ඊතර් ලිපිඩ මත පදනම් වූ නැංගුරමක් ඇති අතර, එහි රසායනික ව්‍යුහය ඉතා දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩයට වඩා බෙහෙවින් වෙනස් වුවද, මෑත අධ්‍යයනයකින් හෙළි වූයේ ලිපිඩ දෙකෙහිම පරිණාමීය වශයෙන් සමාන භෞතික හා රසායනික ගුණාංග සහ ක්‍රියාකාරිත්වය ඇති බවයි (40). එබැවින්, ක්ෂීරපායී සෛලවල ඊතර් ලිපිඩ කොටස යීස්ට් වල C26 සෙරමිඩයට සමාන විය හැකි අතර, එහි කාර්යභාරය වන්නේ GPI-AP එකතු කිරීම සහ වර්ග කිරීම ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා පටලයේ දිගු දාම සෙරමිඩ සමඟ සම්බන්ධ වීමයි. මෙම හැකියාව තවමත් සෘජුවම පරීක්ෂා කළ යුතු වුවද, පෙර සොයාගැනීම් මගින් ගොල්ගි ශරීරයට දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩ් ප්‍රවාහනය සයිටොප්ලාස්මික් හුවමාරු ප්‍රෝටීන මගින් සිදු නොකරන බවත්, යීස්ට් වැනි GPI නැංගුරම් සංස්ලේෂණය මත රඳා පවතින බවත් සනාථ කරයි. එබැවින්, පරිණාමීය ගතානුගතික යාන්ත්‍රණයට එකම ප්‍රවාහන වෙසිකලය තුළ ඉතා දිගු ඇසයිල් දාම සෙරමිඩ් සහ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) තෝරා බේරා සම-ප්‍රවාහනය කිරීමට හැකි බව පෙනේ.
යීස්ට් සහ ක්ෂීරපායී ධ්‍රැවීකරණය වූ එපිටිලියල් සෛල පද්ධතිවල, GPI-AP එකතු කිරීම සහ අනෙකුත් ප්ලාස්මා පටල ප්‍රෝටීන වලින් වෙන් කිරීම සෛල මතුපිටට ළඟා වීමට පෙර සිදු වේ. Paladino et al. (48) සොයා ගත්තේ ක්ෂීරපායී ධ්‍රැවීකරණය වූ එපිටිලියල් සෛලවල TGN මත, GPI-AP පොකුරු කිරීම GPI-APs අග්‍ර ප්ලාස්මා පටලයට තෝරාගත් වර්ගීකරණය සඳහා පමණක් නොව, GPI-APs වල පොකුරු සංවිධානය සහ එහි ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් නියාමනය කරන බවයි. සෛල මතුපිට. යීස්ට් වලදී, මෙම අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ ER මත ඇති C26 සෙරමිඩ් මත යැපෙන GPI-AP පොකුරට ප්ලාස්මා පටලය මත GPI-AP හි පොකුරු සංවිධානය සහ ක්‍රියාකාරී ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කළ හැකි බවයි (24, 49). මෙම ආකෘතියට අනුකූලව, GhLag1 සෛල GPI නිෂේධක හෝ සෛල බිත්ති අඛණ්ඩතාවයට බලපාන ඖෂධ වලට අසාත්මික වේ (28), සහ යීස්ට් සෛල සංසර්ගයේ ප්‍රක්ෂේපණය කරන ලද ඉඟි සෙරමිඩයේ ක්‍රියාකාරී Gas1-GFP පොකුරු (49) සඳහා අවශ්‍යතාවය G පෙන්නුම් කරයි hLag1 සෛලවල ඇති විය හැකි භෞතික විද්‍යාත්මක ප්‍රතිවිපාක. GPI-AP දෝෂය. කෙසේ වෙතත්, ලිපිඩ දිග මත පදනම් වූ වර්ග කිරීමේ ක්‍රමයක් මගින් සෛල මතුපිට ක්‍රියාකාරී සංවිධානය ER වෙතින් වැඩසටහන්ගත කර ඇත්දැයි තවදුරටත් පරීක්ෂා කිරීම අපගේ අනාගත පර්යේෂණයේ විෂය වනු ඇත.
මෙම කාර්යයේදී භාවිතා කරන ලද සැචරොමයිසස් සෙර්විසියා වික්‍රියා වගුව S1 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. සජීවී සෛල ප්‍රතිබිම්බකරණය සඳහා SCLIM හි MMY1583 සහ MMY1635 වික්‍රියා W303 පසුබිම තුළ ඉදිකරන ලදී. ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් ටැගයක් සහිත Sec13-mCherry ප්‍රකාශ කරන මෙම වික්‍රියා පොලිමරේස් දාම ප්‍රතික්‍රියා (PCR) පාදක ක්‍රමයක් භාවිතයෙන් pFA6a ප්ලාස්මිඩ් සමඟ අච්චුවක් ලෙස ඉදිකරන ලදී (23). GAL1 ප්‍රවර්ධකයේ පාලනය යටතේ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් සමඟ ලේබල් කරන ලද Mid2-iRFP ප්‍රකාශ කරන වික්‍රියාව පහත පරිදි ඉදිකරන ලදී. pKTiRFP-KAN දෛශිකයෙන් iRFP-KanMx අනුක්‍රමයේ PCR විස්තාරණය (E. O'Shea ගේ තෑග්ග, Addgene ප්ලාස්මිඩ් අංකය 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; පර්යේෂණ සම්පත් හඳුනාගැනීම (RRID): Addgene_64687) සහ අන්තරාසර්ග Mid2 හි C-පර්යන්තයට ඇතුළත් කර ඇත. Mid2-iRFP ජෙනෝම අනුපිළිවෙල විස්තාරණය කර GAL1 ප්‍රවර්ධකයට ක්ලෝන කළ පසු, එය ඒකාබද්ධ ප්ලාස්මිඩ් pRS306 හි Not I-Sac I අඩවියට ඒකාබද්ධ කරන ලදී. ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබුණු ප්ලාස්මිඩ් pRGS7, URA3 ලොකස් එකට ඒකාබද්ධ කිරීම සඳහා Pst I සමඟ රේඛීය කරන ලදී.
Gas1-GFP විලයන ජානය, පහත පරිදි ගොඩනගා ඇති සෙන්ට්‍රොමීර් (CEN) ප්ලාස්මිඩයේ GAL1 ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ ප්‍රකාශ වේ. Gas1-GFP අනුක්‍රමය pRS416-GAS1-GFP ප්ලාස්මිඩ් (24) (L. Popolo හි තෑග්ග) වෙතින් PCR මගින් විස්තාරණය කරන ලද අතර CEN ප්ලාස්මිඩ් pBEVY-GL LEU2 (C හි තෑග්ග) හි Xma I–Xho I අඩවියට ක්ලෝන කරන ලදී. මිලර්; ඇඩ්ජීන් ප්ලාස්මිඩ් අංකය 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: ඇඩ්ජීන්_51225). ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබුණු ප්ලාස්මිඩය pRGS6 ලෙස නම් කරන ලදී. Axl2-GFP විලයන ජානය pBEVY-GL LEU2 දෛශිකයේ GAL1 ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ ද ප්‍රකාශ වන අතර, එහි ඉදිකිරීම් පහත පරිදි වේ. PCR මගින් pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ප්ලාස්මිඩ් (23) වලින් Axl2-GFP අනුක්‍රමය විස්තාරණය කරන ලද අතර, pBEVY-GL LEU2 දෛශිකයේ Bam HI-Pst I අඩවියට ක්ලෝන කරන ලදී. ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබුණු ප්ලාස්මිඩය pRGS12 ලෙස නම් කරන ලදී. මෙම අධ්‍යයනයේදී භාවිතා කරන ලද ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩවල අනුක්‍රමය S2 වගුවේ ලැයිස්තුගත කර ඇත.
මෙම වික්‍රියාවට 0.2% ඇඩිනීන් සහ 2% ග්ලූකෝස් [YP-ඩෙක්ස්ට්‍රෝස් (YPD)], 2% රෆිනෝස් [YP-රෆිනෝස්] පොහොසත් යීස්ට් සාරය ප්‍රෝටීන් p (YP) මාධ්‍යය (1% යීස්ට් සාරය සහ 2% ප්‍රෝටීන් ept). (YPR)] හෝ 2% ගැලැක්ටෝස් [YP-ගැලැක්ටෝස් (YPG)] කාබන් ප්‍රභවයක් ලෙස හෝ කෘතිම අවම මාධ්‍යයකින් (0.15% යීස්ට් නයිට්‍රජන් පදනම සහ 0.5% ඇමෝනියම් සල්ෆේට්) පෝෂණය සඳහා අවශ්‍ය සුදුසු ඇමයිනෝ අම්ල සහ භෂ්ම අතිරේකව සපයන ලද අතර කාබන් ප්‍රභවයක් ලෙස 2% ග්ලූකෝස් (කෘතිම ග්ලූකෝස් අවම මාධ්‍යය) හෝ 2% ගැලැක්ටෝස් (කෘතිම ගැලැක්ටෝස් අවම මාධ්‍යය) අඩංගු විය.
තත්‍ය කාලීන රූපකරණය සඳහා, GAL1 ප්‍රවර්ධකය යටතේ ගොඩනැගීම ප්‍රකාශ කරන උෂ්ණත්ව සංවේදී sec31-1 විකෘති සෛල YPR මාධ්‍යයේ 24°C සිට මධ්‍ය-ලොග් අවධිය දක්වා එක රැයකින් වගා කරන ලදී. YPG හි 24°C දී පැය 1 ක් ප්‍රේරණය කිරීමෙන් පසු, සෛල SG හි 37°C දී මිනිත්තු 30 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද අතර, පසුව ස්‍රාවය බ්ලොක් එකෙන් මුදා හැරීම සඳහා 24°C වෙත මාරු කරන ලදී. වීදුරු ස්ලයිඩයක් මත සෛල සවි කිරීමට Concanavalin A භාවිතා කරන ලද අතර SCLIM විසින් රූපගත කරන ලදී. SCLIM යනු Olympus IX-71 ප්‍රතිලෝම ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය සහ UPlanSApo 100×1.4 සංඛ්‍යාත්මක විවර තෙල් කාචය (Olympus), අධිවේගී සහ අධි-සංඥා-ශබ්ද අනුපාතය භ්‍රමණය වන තැටි කොන්ෆෝකල් ස්කෑනරය (Yokogawa Electric), අභිරුචි වර්ණාවලීක්ෂය සහ අභිරුචි සිසිලනය යන දෙකෙහිම එකතුවකි. පද්ධතියේ රූප තීව්‍රකාරකය (Hamamatsu Photonics) ×266.7 අවසාන විශාලනයකින් යුත් විශාලන කාච පද්ධතියක් සහ ඉලෙක්ට්‍රෝන ගුණ කරන ආරෝපණ-සම්බන්ධිත උපාංග කැමරාවක් (Hamamatsu Photonics) සැපයිය හැකිය (21). රූප අත්පත් කර ගැනීම අභිරුචි මෘදුකාංග (Yokogawa Electric) මගින් සිදු කෙරේ. ත්‍රිමාණ රූප සඳහා, වෛෂයික කාචය සිරස් අතට කම්පනය කිරීම සඳහා අපි අභිරුචි-සාදන ලද piezoelectric ක්‍රියාකාරකයක් භාවිතා කළ අතර, 100 nm දුරින් දෘශ්‍ය කොටස් තොගයක එකතු කළෙමු. Z-ස්ටැක් රූපය ත්‍රිමාණ වොක්සල් දත්ත බවට පරිවර්තනය කර ඇති අතර, භ්‍රමණය වන තැටි කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය සඳහා භාවිතා කරන න්‍යායාත්මක ලක්ෂ්‍ය පැතිරීමේ ශ්‍රිතය Volocity මෘදුකාංගය (PerkinElmer) විසින් විසංයෝජනය සැකසීම සඳහා භාවිතා කරයි. සම-ස්ථාන විශ්ලේෂණය සඳහා ස්වයංක්‍රීයව එළිපත්ත සඳහා Volocity මෘදුකාංගය භාවිතා කිරීමෙන්, භාණ්ඩ ඇතුළුව ERES මනින ලදී. MetaMorph මෘදුකාංගය (අණුක උපාංග) භාවිතයෙන් රේඛා ස්කෑන් විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම තීරණය කිරීම සඳහා GraphPad Prism මෘදුකාංගය භාවිතා කරන්න. ද්වි-වලිග සහිත ශිෂ්‍යයාගේ t-පරීක්ෂණය සහ විචලතාව පිළිබඳ සාමාන්‍ය ඒක-මාර්ග විශ්ලේෂණය (ANOVA) පරීක්ෂණය සඳහා, කණ්ඩායම් අතර වෙනස්කම් P <0.05 (*) මත සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කරන බව සැලකේ.
Gas1-GFP හි ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය සඳහා, ලොග් අවධි සෛල YPD හි එක රැයකින් වගා කර කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් එකතු කර, පොස්පේට් බෆර් කළ සේලයින් සමඟ දෙවරක් සෝදා, අයිස් මත අවම වශයෙන් විනාඩි 15 ක් තැන්පත් කර, පසුව කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි අන්වීක්ෂය යටතේ චෙක්පත (24) යටතේ ඉදිරියට ගියේය. වෛෂයික කාචයක්, L5 (GFP) පෙරහන, හමාමාට්සු කැමරාව සහ යෙදුම් සූට් X (LAS X) මෘදුකාංගයකින් සමන්විත Leica DMi8 අන්වීක්ෂය (HCX PL APO 1003/1.40 තෙල් PH3 CS) අත්පත් කර ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
සාම්පල 65°C දී SDS සාම්පල බෆරය සමඟ මිනිත්තු 10ක් සඳහා විසංයෝජනය කරන ලද අතර, පසුව SDS-polyacrylamide ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් (PAGE) මගින් වෙන් කරන ලදී. ප්‍රතිශක්තිකරණ අවහිරතා විශ්ලේෂණය සඳහා, එක් මංතීරුවකට සාම්පලයෙන් 10 μl පටවන ලදී. ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය: 1:3000 තනුක කිරීමේදී හාවා පොලික්ලෝනල් ප්‍රති-ගෑස්1, 1:500 තනුක කිරීමේදී හාවා පොලික්ලෝනල් ප්‍රති-එම්පී24 සහ 1:3000 තනුක කිරීමේදී හාවා පොලික්ලෝනල් ප්‍රති-ජීඑෆ්පී (එච්. රීස්මන් වෙතින් තෑග්ගක්) භාවිතා කරන්න. මූසික මොනොක්ලෝනල් ප්‍රති-පීජීකේ1 ප්‍රතිදේහය 1:5000 තනුක කිරීමේදී භාවිතා කරන ලදී (ජේ. ඩි ලා කෲස් වෙතින් තෑග්ගක්). ද්විතියික ප්‍රතිදේහය: අශ්වාරෝහක පෙරොක්සිඩේස් (HRP) සංයුග්මක එළු ප්‍රති-හාවා ප්‍රති-ඉමියුනොග්ලොබුලින් ජී (IgG) 1:3000 (පියර්ස්) තනුක කිරීමේදී භාවිතා කරන ලදී. HRP-සංයුක්ත එළු ප්‍රති-මූසික IgG 1:3000 (පියර්ස්) තනුක කිරීමේදී භාවිතා කරන ලදී. SuperSignal West Pico ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ (Thermo Fisher Scientific) රසායනික දීප්තිය ක්‍රමය මගින් ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර කලාපය නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
(31) හි විස්තර කර ඇති පරිදි, පොහොසත් කරන ලද ER කොටස මත ස්වාභාවික ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණ අත්හදා බැලීමක් සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, 100 දෘශ්‍ය ඝනත්වයකින් දෙවරක් 600 nm (OD600) දී TNE බෆරයෙන් [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ෆීනයිල්මෙතිල්සල්ෆොනයිල් ෆ්ලෝරයිඩ් සහ ප්‍රෝටීස් නිෂේධක මිශ්‍රණය) යීස්ට් සෛල සෝදන්න. එය වීදුරු පබළු සමඟ කැඩී ගිය අතර, පසුව සෛල සුන්බුන් සහ වීදුරු පබළු කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම මගින් ඉවත් කරන ලදී. ඉන්පසු සුපිරි ද්‍රව්‍යය 4°C දී මිනිත්තු 15 ක් සඳහා 17,000 g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. පෙති TNE හි නැවත සවි කරන ලද අතර ඩිජිටල් සැපෝනින් අවසාන සාන්ද්‍රණය 1% ට එකතු කරන ලදී. අත්හිටුවීම 4°C දී භ්‍රමණය සමඟ පැය 1 ක් සඳහා ඉන්කියුබේට් කරන ලද අතර, පසුව දිය නොවන සංරචක 4°C දී 13,000 g දී විනාඩි 60 ක් සඳහා කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම මගින් ඉවත් කරන ලදී. Gas1-GFP ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණය සඳහා, පළමුව නියැදිය හිස් ඇගරෝස් පබළු (ChromoTek) සමඟ 4°C දී පැය 1ක් පූර්ව-ඉන්කියුබේට් කරන්න, පසුව GFP-Trap_A (ChromoTek) සමඟ 4°C දී පැය 3ක් ඉන්කියුබේට් කරන්න. ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපිත පබළු 0.2% ඩිගොක්සිජෙනින් අඩංගු TNE සමඟ පස් වතාවක් සෝදා, SDS සාම්පල බෆරයෙන් ඉවත් කර, SDS-PAGE මත වෙන් කර, ප්‍රතිශක්තිකරණ අවහිර කිරීම මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
(31) හි විස්තර කර ඇති පරිදි, පොහොසත් කරන ලද ER භාගය මත හරස්-සම්බන්ධක නිර්ණය සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, පොහොසත් කරන ලද ER භාගය 0.5 mM ඩයිතියෝබිස් (සුක්සිනිමයිඩයිල් ප්‍රොපියොනේට්) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී (පියර්ස්, තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්, රොක්ෆර්ඩ්, IL, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය; 20°C, මිනිත්තු 20). ග්ලයිසීන් (50 mM අවසාන සාන්ද්‍රණය, මිනිත්තු 5, 20°C) එකතු කිරීමෙන් හරස්-සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාව නිවා දමන ලදී.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි (50), වල්-වර්ගයේ සහ GhLag1 වික්‍රියා වල සෙරමිඩ් වල MS විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, සෛල YPD හි 30°C දී ඝාතීය අවධියට (OD600 ඒකක 3 සිට 4 දක්වා/මිලි ලීටර්) වගා කරන ලද අතර, සෛල 25×107 අස්වැන්න නෙළා ගන්නා ලදී. ඒවායේ පරිවෘත්තීය ට්‍රයික්ලෝරෝඇසිටික් අම්ලය සමඟ සංසිඳුවනු ලැබේ. නිස්සාරණ ද්‍රාවකය [එතනෝල්, ජලය, ඊතර්, පිරිඩීන් සහ 4.2 N ඇමෝනියම් හයිඩ්‍රොක්සයිඩ් (15:15:5:1:0.018 v/v)] සහ අභ්‍යන්තර සම්මත C17 සෙරමිඩ් (860517, අවන්ති ධ්‍රැවීය ලිපිඩ) ගුණාත්මකභාවය 1.2 nmol භාවිතා කරන්න. සාරයේ මෘදු ක්ෂාරීය ජල විච්ඡේදනය සිදු කිරීම සඳහා මොනොමෙතිලමයින් ප්‍රතික්‍රියාකාරකය [මෙතනෝල්, ජලය, n-බියුටනෝල් සහ මෙතිලමයින් ද්‍රාවණය (4:3:1:5 v/v)] භාවිතා කර, පසුව ලුණු ඉවත් කිරීමට ජල-සංතෘප්ත n-බියුටනෝල් භාවිතා කරන්න. අවසාන වශයෙන්, සාරය ධනාත්මක මාදිලියේ ද්‍රාවකයක [ක්ලෝරෝෆෝම්/මෙතනෝල්/ජලය (2:7:1) + 5 mM ඇමෝනියම් ඇසිටේට්] නැවත බන්ධනය කර ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයට එන්නත් කරන ලදී. ස්පින්ගොලිපිඩ් අණු හඳුනා ගැනීම සහ ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා බහු-ප්‍රතික්‍රියා නිරීක්ෂණ (MRM) සිදු කරන ලදී. TSQ Vantage තෘතියික චතුරස්‍ර ධ්‍රැව ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (තාප ෆිෂර් විද්‍යාත්මක) ලිපිඩ විශ්ලේෂණය සඳහා රොබෝ නැනෝ ප්‍රවාහ අයන ප්‍රභවයක් වන නැනෝමේට් HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) සමඟින් සමන්විත වේ. එක් එක් සෙරමිඩ් කාණ්ඩය සඳහා ඝට්ටන ශක්තිය ප්‍රශස්ත කර ඇත. MS දත්ත ධනාත්මක ආකාරයෙන් ලබා ගන්නා ලදී. සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක් සඳහාම, ලිපිඩ සංඥාව ස්වාධීන මිනුම් තුනක මධ්‍යන්‍යය වේ.
(31) හි විස්තර කර ඇති පරිදි, Gas1-GFP ප්‍රකාශ කරන සෛල (800×107) ස්වාභාවික ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණයකට ලක් කරන ලදී. පිරිසිදු කරන ලද Gas1-GFP SDS-PAGE මගින් වෙන් කර පොලිවයිනයිලයිඩීන් ෆ්ලෝරයිඩ් (PVDF) පටලයකට මාරු කරන ලදී. PVDF ඇමයිඩ් කළු පැහැයෙන් පැල්ලම් කිරීමෙන් ප්‍රෝටීන් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී. Gas1-GFP පටිය PVDF වෙතින් කපා මෙතනෝල් සමඟ 5 වතාවක් සහ ද්‍රව ක්‍රෝමැටෝග්‍රැෆි-MS (LC-MS) ශ්‍රේණියේ ජලයෙන් එක් වරක් සෝදා හරින ලදී. පටල තීරුව 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), බෆරය සහ 500μl නැවුම්ව විසුරුවා හරින ලද 1 M සෝඩියම් නයිට්‍රයිට් මිශ්‍රණය 37°C දී පැය 3 ක් සඳහා ඉන්කියුබේට් කිරීමෙන්, ලිපිඩ කොටස Gas1-GFP වෙතින් මුදා හරිනු ලබන අතර ලයිස් කර ඇත (51). ඉන්පසු, පටල තීරුව LC-MS ශ්‍රේණියේ ජලයෙන් හතර වතාවක් සෝදා, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී වියළා, විශ්ලේෂණය තෙක් නයිට්‍රජන් වායුගෝලයේ -80°C දී ගබඩා කරන ලදී. පාලනයක් ලෙස, සෑම අත්හදා බැලීමක් සඳහාම PVDF පටලයේ හිස් සාම්පලයක් භාවිතා කරන ලදී. Gas1-GFP වෙතින් ලබාගත් ලිපිඩ පසුව විස්තර කර ඇති පරිදි MS මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (50). කෙටියෙන් කිවහොත්, GPI-ලිපිඩ් අඩංගු PVDF තීරු 75μl සෘණ අච්චු ද්‍රාවකයක [ක්ලෝරෝෆෝම්/මෙතනෝල් (1:2) + 5 mM ඇමෝනියම් ඇසිටේට්] නැවත අත්හිටුවන ලද අතර ස්පින්ගොලිපිඩ් විශේෂවල (TSQ Vantage) විද්‍යුත් ඉසින අයනීකරණය (ESI)-MRM/MS විශ්ලේෂණය සමත් විය. මෙම අවස්ථාවේදී, MS දත්ත සෘණ අයන ආකාරයෙන් ලබා ගන්නා ලදී.
කලින් සඳහන් කළ පරිදි, GPI නැංගුරමේ ලිපිඩ කොටස [3H]-ඉනොසිටෝල්-ලේබල් කරන ලද GPI-AP (16) වලින් වෙන් කරන ලදී. ලිපිඩ ද්‍රාවක පද්ධතියක් (55:45:10 ක්ලෝරෝෆෝම්-මෙතනෝල්-0.25% KCl) භාවිතයෙන් තුනී ස්ථර වර්ණදේහ මගින් වෙන් කරන ලද අතර FLA-7000 (Fujifilm) භාවිතයෙන් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.
Gas1-GFP (600×107) ප්‍රකාශ කරන සෛල TNE බෆරය සමඟ TNE බෆරයෙන් දෙවරක් සෝදා, වීදුරු පබළු වලින් කැඩී, සෛල සුන්බුන් සහ වීදුරු පබළු ඉවත් කිරීම සඳහා කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. ඉන්පසු සුපිරි විච්ඡේදකය 4°C දී පැය 1 ක් සඳහා 17,000 g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. පෙති TNE හි සෝදා 37°C දී පැය 1 ක් සඳහා 0.2% ඩිජිටල් සැපෝනින් අඩංගු TNE හි 1 U PI-PLC (Invitrogen) සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. එන්සයිම ප්‍රතිකාරයෙන් පසු, පටලය පැය 1 ක් සඳහා 4°C දී 17,000 g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමෙන් ඉවත් කරන ලදී. Gas1-GFP ප්‍රතිශක්තිකරණ අවක්ෂේපණය කිරීම සඳහා, සුපිරි විච්ඡේදකය 4°C දී එක රැයකින් GFP-Trap_A (ChromoTek) සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. SDS-PAGE මගින් වෙන් කරන ලද පිරිසිදු කරන ලද Gas1-GFP Coomassie brilliant blue වලින් පැල්ලම් කරන ලදී. ජලධරය වටා ඇති අළු පැහැයෙන් Gas1-GFP පැල්ලම් පටිය කපා ඉවත් කරන ලද අතර, පසුව අයඩෝඇසිටමයිඩ් සමඟ ඇල්කයිලීකරණය කිරීමෙන් සහ ඩයිතියෝත්‍රයිටෝල් සමඟ අඩු කිරීමෙන් පසුව, ට්‍රිප්සින් සමඟ ජෙල් ජීර්ණය සිදු කරන ලදී. GPI-ග්ලයිකන් සමඟ ට්‍රිප්ටික් පෙප්ටයිඩ සහ පෙප්ටයිඩ නිස්සාරණය කර වියළා ගන්න. වියලන ලද පෙප්ටයිඩය ජලයේ 20 μl තුළ දිය කරන ලදී. LC තුළට කොටසක් (8μl) එන්නත් කරන්න. නිශ්චිත අනුක්‍රමික තත්වයන් යටතේ පෙප්ටයිඩ වෙන් කිරීම සඳහා ඔක්ටඩෙසයිල්සිලේන් (ODS) තීරුවක් (ඩෙවෙලොසිල් 300ODS-HG-5; අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භය 150 mm×1.0 mm; නොමුරා කෙමිකල්, අයිචි ප්‍රාන්තය, ජපානය) භාවිතා කරන ලදී. ජංගම අවධිය ද්‍රාවක A (0.08% ෆෝමික් අම්ලය) සහ ද්‍රාවක B (80% ඇසිටොනයිට්‍රයිල් හි 0.15% ෆෝමික් අම්ලය) වේ. මිනිත්තු 55ක් ඇතුළත ද්‍රාවක A සමඟ තීරුව ඉවත් කිරීම සඳහා Accela HPLC පද්ධතියක් (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) භාවිතා කරන ලද අතර, මිනිත්තු 5ක් සඳහා 50 μl min-1 ප්‍රවාහ අනුපාතයකින්, පසුව B ද්‍රාවකයේ සාන්ද්‍රණය 40% දක්වා වැඩි කරන ලදී. , එක්සත් ජනපදය). ESI අයන ප්‍රභවයට එලියුටේට් අඛණ්ඩව හඳුන්වා දෙන ලද අතර, GPI-ග්ලයිකන් සහිත ට්‍රිප්ටික් පෙප්ටයිඩ සහ පෙප්ටයිඩ LTQ Orbitrap XL (දෙමුහුන් රේඛීය අයන උගුල්-ඕර්බිට්‍රැප් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය; Thermo Fisher Scientific) මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. MS සැකසුම තුළ, කේශනාලිකා ප්‍රභවයේ වෝල්ටීයතාවය 4.5 kV ලෙස සකසා ඇති අතර, මාරු කේශනාලිකා උෂ්ණත්වය 300°C ලෙස තබා ඇත. කේශනාලිකා වෝල්ටීයතාවය සහ නල කාච වෝල්ටීයතාවය පිළිවෙලින් 15 V සහ 50 V ලෙස සකසා ඇත. MS දත්ත ධනාත්මක අයන මාදිලියෙන් (විභේදනය 60,000; ස්කන්ධ නිරවද්‍යතාවය මිලියනයකට කොටස් 10) 300/m/z ස්කන්ධ/ආරෝපණ අනුපාතය (m/z) 3000 ස්කන්ධ පරාසයකින් ලබා ගන්නා ලදී. MS/MS දත්ත LTQ Orbitrap XL හි අයන උගුල හරහා ලබා ගනී [දත්ත රඳා පවතින පළමු ඉලක්කම් 3, ගැටුම් ප්‍රේරිත විඝටනය (CID)].
GROMACS (52) මෘදුකාංගය සහ MARTINI 2 බල ක්ෂේත්‍රය (53-55) භාවිතයෙන් MD සමාකරණ සිදු කරන ලදී. පසුව CHARMM GUI පටල සාදන්නා (56, 57) ඩයෝලියොයිල්ෆොස්ෆැටිඩයිල්කොලීන් (DOPC) සහ Cer C18 හෝ DOPC සහ Cer C26 අඩංගු ද්වි ස්ථරයක් තැනීමට භාවිතා කරන ලදී. Cer C26 හි ස්ථලකය සහ ඛණ්ඩාංක DXCE වෙතින් ලබාගෙන ඇත්තේ ස්පින්ගෝසීන් වලිගයෙන් අමතර පබළු ඉවත් කිරීමෙනි. ද්විත්ව ස්ථරය සමතුලිත කිරීමට සහ එය ක්‍රියාත්මක කිරීමට පහත විස්තර කර ඇති ක්‍රියාවලිය භාවිතා කරන්න, ඉන්පසු Emp24 අඩංගු පද්ධතියක් ගොඩනැගීමට පද්ධතියේ අවසාන ඛණ්ඩාංක භාවිතා කරන්න. යීස්ට් Emp24 හි ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් වසම (අවශේෂ 173 සිට 193 දක්වා) දෘශ්‍ය MD (VMD) මෙවලම් අණුක ව්‍යුහය (58) භාවිතයෙන් α-හෙලික්සයක් ලෙස ඉදිකරන ලදී. ඉන්පසු, අතිච්ඡාදනය වන ලිපිඩ ඉවත් කිරීමෙන් පසු, ප්‍රෝටීනය රළු ලෙස කැටි ගැසී CHARMM GUI භාවිතයෙන් ද්වි ස්ථරයට ඇතුළු කරන ලදී. අවසාන පද්ධතියේ DOPC 1202 ක් සහ Cer C26 302 ක් හෝ DOPC 1197 ක් සහ Cer C18 සහ Emp24 295 ක් අඩංගු වේ. පද්ධතිය 0.150M සාන්ද්‍රණයකට අයනීකරණය කරන්න. ද්වි ස්ථර සංයුති දෙකක් සඳහා ස්වාධීන අනුපිටපත් හතරක් සාදන ලදී.
ලිපිඩ ද්වි ස්ථරය CHARMM GUI ක්‍රියාවලිය භාවිතයෙන් සමතුලිත කර ඇති අතර, එයට පියවර 405,000 ක් අවම කර සමතුලිත කිරීම ඇතුළත් වන අතර, එහිදී ස්ථාන සීමාවන් ක්‍රමයෙන් අඩු කර ඉවත් කරනු ලබන අතර, කාල පියවර 0.005 ps සිට 0.02 ps දක්වා වැඩි කෙරේ. සමතුලිතතාවයෙන් පසු, එය 0.02 ps කාල පියවරක් සමඟ 6 µs නිපදවයි. Emp24 ඇතුළු කිරීමෙන් පසු, පද්ධතිය අවම කර සමතුලිත කිරීමට එම CHARMM GUI ක්‍රියාවලියම භාවිතා කර, නිෂ්පාදනයේ තත්පර 8 ක් ක්‍රියාත්මක කරන්න.
සියලුම පද්ධති සඳහා, තුලනය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, පීඩනය බෙරෙන්ඩ්සන් බැරොස්ටැට් (59) මගින් පාලනය වන අතර, නිෂ්පාදන ක්‍රියාවලියේදී, පීඩනය පාලනය කරනු ලබන්නේ පැරිනෙලෝ-රහ්මාන් බැරොස්ටැට් (60) මගිනි. සෑම අවස්ථාවකදීම, සාමාන්‍ය පීඩනය බාර් 1 ක් වන අතර අර්ධ-සමස්ථානික පීඩන සම්බන්ධක යෝජනා ක්‍රමයක් භාවිතා කරයි. සමතුලිතතාවය සහ නිෂ්පාදන ක්‍රියාවලියේදී, ප්‍රෝටීන්, ලිපිඩ සහ ද්‍රාවක අංශුවල උෂ්ණත්වය පිළිවෙලින් යුගල කිරීම සඳහා වේග නැවත ක්‍රමාංකනය සහිත තාප ස්ථායයක් (61) භාවිතා කරයි. සම්පූර්ණ ක්‍රියාකාරිත්වය අතරතුර, ඉලක්කගත උෂ්ණත්වය 310K වේ. බන්ධන නොවන අන්තර්ක්‍රියාව ගණනය කරනු ලබන්නේ 0.005 බෆර් ඉවසීමක් සහිත වර්ලට් යෝජනා ක්‍රමය භාවිතයෙන් යුගල ලැයිස්තුවක් ජනනය කිරීමෙනි. කූලෝම් පදය ගණනය කරනු ලබන්නේ ප්‍රතික්‍රියා ක්ෂේත්‍රය සහ 1.1 nm ක කැපුම් දුරක් භාවිතා කරමිනි. වැන්ඩර් වෝල්ස් පදය 1.1 nm ක කැපුම් දුරක් සහිත කැපුම් යෝජනා ක්‍රමයක් භාවිතා කරන අතර, වර්ලට් කැපුම් යෝජනා ක්‍රමය විභව ප්ලාවිතය සඳහා භාවිතා කරයි (62).
VMD භාවිතා කරමින්, DOPC පොස්පේට් පබළු හෝ සෙරමිඩ් AM1 පබළු සහ ප්‍රෝටීනය අතර කැපුම් තරංග ආයාමය 0.7 nm වන අතර, ප්‍රෝටීනය සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන ලිපිඩ ගණන ගණනය කෙරේ. පහත සූත්‍රයට අනුව, (63) හි පරිදි ක්ෂය-පොහොසත් කිරීමේ (DE) සාධකය ගණනය කරන්න: DE සාධකය = (ප්‍රෝටීනයේ මුළු ලිපිඩ ප්‍රමාණය 0.7) ප්‍රෝටීනය 0.7 හි (මුළු ලිපිඩවල Cer ප්‍රමාණය)
වාර්තා කරන ලද අගය සාමාන්‍යයක් ලෙස ලබා ගන්නා අතර, දෝෂ තීරු SE හි ස්වාධීන පිටපත් හතරකි. DE සාධකයේ සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම t පරීක්ෂණය [(සාමාන්‍යDE-සාධකය-1)/SE] මගින් ගණනය කෙරේ. තනි වලිග ව්‍යාප්තියෙන් P අගය ගණනය කරන්න.
GROMACS මෙවලම භාවිතා කර ඇත්තේ හෝඩුවාවේ අවසාන ns 250 තුළ Emp24 අඩංගු පද්ධතියේ 2D පාර්ශ්වීය ඝනත්ව සිතියම ගණනය කිරීමටයි. සෙරමිඩයේ පොහොසත් කිරීමේ/ක්ෂය කිරීමේ සිතියම ලබා ගැනීම සඳහා, Cer හි ඝනත්ව සිතියම Cer සහ DOPC සිතියමේ එකතුවෙන් බෙදනු ලබන අතර, පසුව ශරීරයේ Cer සාන්ද්‍රණයෙන් බෙදනු ලැබේ. එකම වර්ණ සිතියම් පරිමාණය භාවිතා වේ.
මෙම ලිපිය සඳහා අතිරේක ද්‍රව්‍ය සඳහා, කරුණාකර http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 බලන්න.
මෙය Creative Commons Attribution-Non-Commercial බලපත්‍රයේ නියමයන් යටතේ බෙදා හරින ලද විවෘත ප්‍රවේශ ලිපියකි, එය අවසාන භාවිතය වාණිජමය වාසි සඳහා නොවන තාක් කල් සහ මුල් කෘතිය නිවැරදි බව උපකල්පනය කරන තාක් කල්, ඕනෑම මාධ්‍යයකින් භාවිතය, බෙදා හැරීම සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීමට ඉඩ සලසයි. යොමුව.
සටහන: අපි ඔබෙන් ඉල්ලා සිටින්නේ ඔබගේ විද්‍යුත් තැපැල් ලිපිනය ලබා දෙන ලෙසයි, එවිට ඔබ පිටුවට නිර්දේශ කරන පුද්ගලයාට ඔබට විද්‍යුත් තැපෑල දැකීමට අවශ්‍ය බවත් එය ස්පෑම් නොවන බවත් දැනගත හැකිය. අපි කිසිදු විද්‍යුත් තැපැල් ලිපිනයක් ග්‍රහණය නොකරමු.
ඔබ අමුත්තෙකු දැයි පරීක්ෂා කිරීමට සහ ස්වයංක්‍රීය ස්පෑම් ඉදිරිපත් කිරීම වැළැක්වීමට මෙම ප්‍රශ්නය භාවිතා කරයි.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Lopeezero, Aguilera-Romero, (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
තෝරාගත් ප්‍රතිදාන ස්ථානවල ප්‍රෝටීන් වර්ග කිරීම සඳහා සෙරමිඩ් දාමයේ දිගෙහි වැදගත්කම ත්‍රිමාණ අධි-විභේදන තත්‍ය කාලීන රූපකරණයෙන් හෙළි වේ.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Lopeezero, Aguilera-Romero, (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
තෝරාගත් ප්‍රතිදාන ස්ථානවල ප්‍රෝටීන් වර්ග කිරීම සඳහා සෙරමිඩ් දාමයේ දිගෙහි වැදගත්කම ත්‍රිමාණ අධි-විභේදන තත්‍ය කාලීන රූපකරණයෙන් හෙළි වේ.
©2020 විද්‍යාවේ දියුණුව සඳහා වූ ඇමරිකානු සංගමය. සියලු හිමිකම් ඇවිරිණි. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef සහ COUNTER හි හවුල්කරුවෙකි. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.