අක්මාවේ ෆයිබ්‍රෝසිස් ඇති රෝගීන් තුළ බඩවැල් වලින් ලබාගත් ට්‍රිප්ටෝෆාන් පරිවෘත්තීය ඉන්ඩෝල්-3-ප්‍රොපියොනික් අම්ලයේ (IPA) සෙරුම් මට්ටම් අඩු බව අපි මීට පෙර වාර්තා කළෙමු. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, සෙරුම් IPA මට්ටම්වලට සාපේක්ෂව තරබාරු අක්මා වල ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටෝම් සහ DNA මෙතිලෝම් මෙන්ම, විට්‍රෝ හි හෙපටික ස්ටෙලේට් සෛල (HSCs) වල ෆීනෝටයිපික් අක්‍රියකරණය ඇති කිරීමේදී IPA හි කාර්යභාරය පිළිබඳව අපි විමර්ශනය කළෙමු.
මෙම අධ්‍යයනයට කුඕපියෝ බැරිට්‍රික් සැත්කම් මධ්‍යස්ථානයේ (KOBS) බරාත්‍රික සැත්කම්වලට භාජනය වූ දෙවන වර්ගයේ දියවැඩියාව (T2DM) නොමැති (වයස අවුරුදු 46.8 ± 9.3; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) තරබාරු රෝගීන් 116 දෙනෙකු ඇතුළත් විය. සංසරණ IPA මට්ටම් ද්‍රව වර්ණදේහ-ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (LC-MS) මගින් මනිනු ලැබීය, අක්මා පිටපත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය සම්පූර්ණ RNA අනුපිළිවෙල මගින් සිදු කරන ලදී, සහ DNA මෙතිලේෂන් විශ්ලේෂණය Infinium HumanMethylation450 BeadChip භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. මිනිස් හෙපටික තාරකා සෛල (LX-2) අභ්‍යන්තර අත්හදා බැලීම් සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
අක්මාවේ ඇපොප්ටෝටික්, මයිටොෆැජික් සහ දීර්ඝායුෂ මාර්ගවලට සම්බන්ධ ජානවල ප්‍රකාශනය සමඟ සෙරුම් IPA මට්ටම් සහසම්බන්ධ වේ. AKT සෙරීන්/ත්‍රෙයොනීන් කයිනාස් 1 (AKT1) ජානය අක්මා පිටපත් කිරීමේ සහ DNA මෙතිලේෂන් පැතිකඩවල වඩාත් බහුල සහ ප්‍රමුඛ අන්තර්ක්‍රියාකාරී ජානය විය. IPA ප්‍රතිකාරය මගින් ඇපොප්ටෝසිස් ඇති කරන ලදී, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනය අඩු විය, සහ LX-2 සෛලවල ෆයිබ්‍රෝසිස්, ඇපොප්ටෝසිස් සහ පැවැත්ම නියාමනය කරන ජානවල ප්‍රකාශනය මොඩියුලේට් කිරීම මගින් සෛල රූප විද්‍යාව සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකත්වය වෙනස් කරන ලදී.
එකට ගත් කල, මෙම දත්ත IPA වලට විභව චිකිත්සක බලපෑම් ඇති බවත්, ඇපොප්ටෝසිස් ඇති කිරීමට සහ HSC ෆීනෝටයිප් අක්‍රිය තත්වයකට මාරු කළ හැකි බවත්, එමඟින් HSC සක්‍රිය කිරීම සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට බාධා කිරීමෙන් අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් නිෂේධනය කිරීමේ හැකියාව පුළුල් කරන බවත් සනාථ කරයි.
තරබාරුකම හා පරිවෘත්තීය සින්ඩ්‍රෝමයේ ව්‍යාප්තිය පරිවෘත්තීය සම්බන්ධ මේද අක්මා රෝග (MASLD) වැඩි වීමේ සිදුවීම් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇත; මෙම රෝගය සාමාන්‍ය ජනගහනයෙන් 25% සිට 30% දක්වා බලපායි [1]. MASLD හේතු විද්‍යාවේ ප්‍රධාන ප්‍රතිවිපාකය වන්නේ අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් වන අතර එය තන්තුමය බාහිර සෛල අනුකෘතිය (ECM) අඛණ්ඩව සමුච්චය වීම මගින් සංලක්ෂිත ගතික ක්‍රියාවලියකි [2]. අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් වලට සම්බන්ධ ප්‍රධාන සෛල වන්නේ හෙපටික තාරකා සෛල (HSCs) වන අතර ඒවා දන්නා ෆීනෝටයිප් හතරක් ප්‍රදර්ශනය කරයි: නිශ්චල, සක්‍රිය, අක්‍රිය සහ වයෝවෘද්ධ [3, 4]. HSCs සක්‍රිය කර ඉහළ ශක්ති ඉල්ලුමක් ඇති ප්‍රගුණන ෆයිබ්‍රෝබ්ලාස්ට් වැනි සෛල බවට පරිවර්තනය කළ හැකිය, α-සුමට මාංශ පේශි ඇක්ටින් (α-SMA) සහ I වර්ගයේ කොලජන් (Col-I) [5, 6] වැඩි ප්‍රකාශනයක් සමඟ. අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ප්‍රතිවර්තනය අතරතුර, සක්‍රිය HSCs ඇපොප්ටෝසිස් හෝ අක්‍රිය කිරීම හරහා ඉවත් කරනු ලැබේ. මෙම ක්‍රියාවලීන් අතර ෆයිබ්‍රොජනික් ජාන අඩු කිරීම සහ ප්‍රොසර්වයිවල් ජාන මොඩියුලේෂන් (NF-κB සහ PI3K/Akt සංඥා මාර්ග වැනි) [7, 8] මෙන්ම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකයේ සහ ක්‍රියාකාරිත්වයේ වෙනස්කම් [9] ඇතුළත් වේ.
අන්ත්‍රයේ නිපදවන ට්‍රිප්ටෝෆාන් පරිවෘත්තීය ඉන්ඩෝල්-3-ප්‍රොපියොනික් අම්ලයේ (IPA) සෙරුම් මට්ටම්, MASLD [10–13] ඇතුළු මිනිස් පරිවෘත්තීය රෝග වලදී අඩු වී ඇති බව සොයාගෙන ඇත. IPA ආහාරමය තන්තු පරිභෝජනය සමඟ සම්බන්ධ වේ, එහි ප්‍රතිඔක්සිකාරක සහ ප්‍රති-ගිනි අවුලුවන බලපෑම් සඳහා ප්‍රසිද්ධය, සහ ආහාර මගින් ඇති කරන ලද මධ්‍යසාර නොවන ස්ටීටෝහෙපටයිටිස් (NASH) ෆීනෝටයිප් ඉන් වීවෝ සහ ඉන් වීට්‍රෝ [11–14] දුර්වල කරයි. කුඕපියෝ බැරිට්‍රික් සැත්කම් අධ්‍යයනයේ (KOBS) අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් නොමැති තරබාරු රෝගීන්ට වඩා අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ඇති රෝගීන් තුළ සෙරුම් IPA මට්ටම් අඩු බව පෙන්නුම් කළ අපගේ පෙර අධ්‍යයනයෙන් සමහර සාක්ෂි ලැබේ. තවද, IPA ප්‍රතිකාරය මිනිස් අක්මා ස්ටෙලේට් සෛල (LX-2) ආකෘතියක සෛල ඇලවීම, සෛල සංක්‍රමණය සහ රක්තපාත කඳ සෛල සක්‍රිය කිරීමේ සම්භාව්‍ය සලකුණු වන ජානවල ප්‍රකාශනය අඩු කළ හැකි බවත් එය විභව හෙපටොප්‍රොටෙක්ටිව් පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයක් බවත් අපි පෙන්වා දුන්නෙමු [15]. කෙසේ වෙතත්, HSC ඇපොප්ටෝසිස් සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෛව ශක්තිජනක සක්‍රිය කිරීමෙන් IPA අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ප්‍රතිගාමීත්වය ඇති කරන්නේ කෙසේද යන්න තවමත් පැහැදිලි නැත.
මෙහිදී, අපි පෙන්නුම් කරන්නේ තරබාරු නමුත් දෙවන වර්ගයේ දියවැඩියාව (KOBS) නොමැති පුද්ගලයින්ගේ අක්මාව තුළ ඇපොප්ටෝසිස්, මයිටොෆැජි සහ දීර්ඝායුෂ මාර්ග වලින් පොහොසත් ජාන ප්‍රකාශනය සමඟ සෙරුම් IPA සම්බන්ධ වී ඇති බවයි. තවද, අක්‍රිය මාර්ගය හරහා සක්‍රිය රක්තපාත කඳ සෛල (HSCs) නිෂ්කාශනය හා පිරිහීම ඇති කිරීමට IPA හට හැකි බව අපි සොයා ගත්තෙමු. මෙම ප්‍රතිඵල IPA සඳහා නව කාර්යභාරයක් හෙළි කරන අතර, එය අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ප්‍රතිගාමීත්වය ප්‍රවර්ධනය කිරීමේ විභව චිකිත්සක ඉලක්කයක් බවට පත් කරයි.
KOBS කණ්ඩායම තුළ කළ පෙර අධ්‍යයනයකින් පෙන්නුම් කළේ අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ඇති රෝගීන්ට අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් නොමැති රෝගීන් හා සසඳන විට අඩු සංසරණ IPA මට්ටම් ඇති බවයි [15]. දෙවන වර්ගයේ දියවැඩියාවේ විභව ව්‍යාකූල බලපෑම බැහැර කිරීම සඳහා, අපි 2 වර්ගයේ දියවැඩියාව නොමැති තරබාරු රෝගීන් 116 දෙනෙකු (මධ්‍යන්‍ය වයස ± SD: අවුරුදු 46.8 ± 9.3; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (වගුව 1) අධ්‍යයන ජනගහනය ලෙස දැනට කරගෙන යන KOBS අධ්‍යයනයෙන් බඳවා ගත්තෙමු [16]. සියලුම සහභාගිවන්නන් ලිඛිත දැනුම්වත් කැමැත්තක් ලබා දුන් අතර හෙල්සින්කි ප්‍රකාශනයට (54/2005, 104/2008 සහ 27/2010) අනුකූලව උතුරු සැවෝ ප්‍රාන්ත රෝහලේ ආචාර ධර්ම කමිටුව විසින් අධ්‍යයන ප්‍රොටෝකෝලය අනුමත කරන ලදී.
බරාට්‍රික් සැත්කම් අතරතුර අක්මා බයොප්සි සාම්පල ලබා ගන්නා ලද අතර කලින් විස්තර කරන ලද නිර්ණායක [17, 18] අනුව පළපුරුදු ව්‍යාධි විද්‍යාඥයින් විසින් හිස්ටොලොජිකල් ලෙස තක්සේරු කරන ලදී. තක්සේරු නිර්ණායක අතිරේක වගුව S1 හි සාරාංශ කර ඇති අතර කලින් විස්තර කර ඇත [19].
පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය සඳහා ඉලක්ක නොකළ ද්‍රව වර්ණදේහ-ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (LC-MS) මගින් නිරාහාර සෙරුම් සාම්පල විශ්ලේෂණය කරන ලදී (n = 116). සාම්පල කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි UHPLC-qTOF-MS පද්ධතියක් (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. අයිසොප්‍රොපයිල් මධ්‍යසාර (IPA) හඳුනා ගැනීම රඳවා ගැනීමේ කාලය සහ MS/MS වර්ණාවලිය පිරිසිදු ප්‍රමිතීන් සමඟ සංසන්දනය කිරීම මත පදනම් විය. IPA සංඥා තීව්‍රතාවය (උච්ච ප්‍රදේශය) සියලුම වැඩිදුර විශ්ලේෂණයන්හි සලකා බලන ලදී [20].
ඉලුමිනා හයිසෙක් 2500 භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ අක්මා ආර්එන්ඒ අනුක්‍රමණය සිදු කරන ලද අතර කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි දත්ත පූර්ව සැකසුම් කරන ලදී [19, 21, 22]. මයිටොමයිනර් 4.0 දත්ත සමුදායෙන් තෝරාගත් 1957 ජාන භාවිතා කරමින් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයට/ජෛවජනනයට බලපාන පිටපත් වල ඉලක්කගත අවකල ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය අපි සිදු කළෙමු [23]. කලින් විස්තර කර ඇති ආකාරයටම ක්‍රමවේදය භාවිතා කරමින් ඉන්ෆීනියම් හියුමන්මෙතිලේෂන් 450 බීඩ්චිප් (ඉලුමිනා, සැන් ඩියාගෝ, කැලිෆෝනියා, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) භාවිතයෙන් අක්මා ඩීඑන්ඒ මෙතිලේෂන් විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී [24, 25].
මානව අක්මා තාරකා සෛල (LX-2) මහාචාර්ය ස්ටෙෆානෝ රෝමියෝ විසින් කාරුණිකව සපයන ලද අතර DMEM/F12 මාධ්‍යයෙන් (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) වගා කර නඩත්තු කරන ලදී. IPA හි ක්‍රියාකාරී මාත්‍රාව තෝරා ගැනීම සඳහා, LX-2 සෛල පැය 24 ක් සඳහා DMEM/F12 මාධ්‍යයෙන් විවිධ සාන්ද්‍රණ IPA (10 μM, 100 μM සහ 1 mM; Sigma, 220027) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලදී. තවද, IPA හි HSC අක්‍රිය කිරීමේ හැකියාව විමර්ශනය කිරීම සඳහා, LX-2 සෛල පැය 24 ක් සඳහා සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයෙන් 5 ng/ml TGF-β1 (R&D පද්ධති, 240-B-002/CF) සහ 1 mM IPA සමඟ සම-ප්‍රතිකාර කරන ලදී. අනුරූප වාහන පාලන සඳහා, TGF-β1 ප්‍රතිකාර සඳහා 0.1% BSA අඩංගු 4 nM HCL සහ IPA ප්‍රතිකාර සඳහා 0.05% DMSO භාවිතා කරන ලද අතර, ඒකාබද්ධ ප්‍රතිකාර සඳහා දෙකම එකට භාවිතා කරන ලදී.
නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) සහිත FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit භාවිතයෙන් Apoptosis තක්සේරු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, LX-2 (1 × 105 සෛල/ළිඳ) එක රැයකින් ළිං 12 තහඩු තුළ වගා කරන ලද අතර පසුව IPA හෝ IPA සහ TGF-β1 මාත්‍රා කිහිපයකින් ප්‍රතිකාර කරන ලදී. ඊළඟ දිනයේ, පාවෙන සහ ඇලෙන සුළු සෛල එකතු කර, ට්‍රිප්සිනීකරණය කර, PBS සමඟ සෝදා, Annexin V බන්ධන බෆරයේ නැවත සවි කර, FITC-Annexin V සහ 7-AAD සමඟ විනාඩි 15 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී.
මයිටොට්‍රැකර්™ රතු CMXRos (MTR) (තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්, කාල්ස්බෑඩ්, CA) භාවිතයෙන් ඔක්සිකාරක ක්‍රියාකාරකම් සඳහා ජීව සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියා වර්ණ ගැන්වූහ. MTR පරීක්ෂණ සඳහා, LX-2 සෛල IPA සහ TGF-β1 සමඟ සමාන ඝනත්වයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. පැය 24 කට පසු, ජීව සෛල ට්‍රයිප්සිනීකරණය කර, PBS සමඟ සෝදා, පසුව කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි මිනිත්තු 20 ක් සඳහා 37 °C දී සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයේ 100 μM MTR සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී [26]. සජීවී සෛල රූප විද්‍යාත්මක විශ්ලේෂණය සඳහා, සෛල ප්‍රමාණය සහ සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතාව පිළිවෙලින් ඉදිරි විසිරීම (FSC) සහ පැති විසිරීම (SSC) පරාමිතීන් භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
සියලුම දත්ත (සිදුවීම් 30,000) NovoCyte Quanteon (Agilent) භාවිතයෙන් ලබාගෙන NovoExpress® 1.4.1 හෝ FlowJo V.10 මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව, සීහෝර්ස් එක්ස්එෆ් සෛල මිටෝ ආතතියකින් සමන්විත සීහෝර්ස් එක්ස්ක්‍රසෙලියුලර් ෆ්ලක්ස් විශ්ලේෂකයක් (ඇජිලන්ට් ටෙක්නොලොජීස්, සැන්ටා ක්ලාරා, කැලිෆෝනියා) භාවිතයෙන් ඔක්සිජන් පරිභෝජන අනුපාතය (OCR) සහ බාහිර සෛලීය ආම්ලිකකරණ අනුපාතය (ECAR) තත්‍ය කාලීනව මනිනු ලැබීය. කෙටියෙන් කිවහොත්, 2 × 104 LX-2 සෛල/ළිඳ XF96 සෛල සංස්කෘතික තහඩු මතට බීජ කරන ලදී. එක රැයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසු, සෛල අයිසොප්‍රොපනෝල් (IPA) සහ TGF-β1 (පරිපූරක ක්‍රම 1) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලදී. සීහෝර්ස් එක්ස්එෆ් සෛල ශක්ති ෆීනෝටයිප් පරීක්ෂණ වාර්තා උත්පාදක යන්ත්‍රය ඇතුළත් සීහෝර්ස් එක්ස්එෆ් තරංග මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. මෙයින්, ජෛව ශක්තිජනක සෞඛ්‍ය දර්ශකයක් (BHI) ගණනය කරන ලදී [27].
මුළු RNA cDNA බවට පිටපත් කරන ලදී. නිශ්චිත ක්‍රම සඳහා, යොමුව [15] බලන්න. මානව 60S රයිබසෝම ආම්ලික ප්‍රෝටීන් P0 (RPLP0) සහ සයික්ලොෆිලින් A1 (PPIA) mRNA මට්ටම් ව්‍යුහාත්මක ජාන පාලනයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR පද්ධතිය (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) හෝ Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) සමඟ භාවිතා කරන ලද අතර, සංසන්දනාත්මක Ct අගය චක්‍රීය පරාමිතීන් (ΔΔCt) සහ ∆∆Ct ක්‍රමය භාවිතයෙන් සාපේක්ෂ ජාන ප්‍රකාශන ගුණය ගණනය කරන ලදී. ප්‍රයිමර් පිළිබඳ විස්තර අතිරේක වගු S2 සහ S3 හි දක්වා ඇත.
පෙර [28] විස්තර කර ඇති පරිදි DNeasy රුධිර හා පටක කට්ටලය (Qiagen) භාවිතයෙන් න්‍යෂ්ටික DNA (ncDNA) සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA (mtDNA) නිස්සාරණය කරන ලදී. අතිරේක ක්‍රම 2 හි විස්තර කර ඇති පරිදි, එක් එක් ඉලක්කගත mtDNA කලාපයේ අනුපාතය න්‍යෂ්ටික DNA කලාප තුනේ (mtDNA/ncDNA) ජ්‍යාමිතික මධ්‍යන්‍යයට ගණනය කිරීමෙන් mtDNA හි සාපේක්ෂ ප්‍රමාණය ගණනය කරන ලදී. mtDNA සහ ncDNA සඳහා ප්‍රාථමික පිළිබඳ විස්තර අතිරේක වගුව S4 හි දක්වා ඇත.
අන්තර් සෛලීය සහ අන්තර් සෛලීය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාල දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා සජීවී සෛල Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) සමඟ වර්ණ ගැන්වීය. LX-2 සෛල (1 × 104 සෛල/ළිඳ) අනුරූප වීදුරු-පහළ සංස්කෘතික තහඩු වල වීදුරු ස්ලයිඩ මත වගා කරන ලදී (Ibidi GmbH, Martinsried, ජර්මනිය). පැය 24 කට පසු, සජීවී LX-2 සෛල 37 °C දී මිනිත්තු 20 ක් සඳහා 100 μM MTR සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද අතර සෛල න්‍යෂ්ටීන් කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) සමඟ පැල්ලම් කරන ලදී [29]. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාල දෘශ්‍යමාන කරන ලද්දේ 63×NA 1.3 අරමුණක් භාවිතා කරමින් 5% CO2 සහිත ආර්ද්‍රිත වායුගෝලයක 37 °C දී Zeiss LSM 800 confocal මොඩියුලයකින් සමන්විත Zeiss Axio Observer ප්‍රතිලෝම අන්වීක්ෂයක් (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) භාවිතා කරමිනි. අපි එක් එක් සාම්පල වර්ගය සඳහා Z-ශ්‍රේණියේ රූප දහයක් ලබා ගත්තෙමු. සෑම Z-ශ්‍රේණියකම කොටස් 30 ක් අඩංගු වන අතර, ඒ සෑම එකක්ම 9.86 μm ඝණකමකින් යුක්ත වේ. සෑම සාම්පලයක් සඳහාම, ZEN 2009 මෘදුකාංගය (කාල් සයිස් මයික්‍රොඉමේජින් GmbH, ජෙනා, ජර්මනිය) භාවිතයෙන් විවිධ දර්ශන ක්ෂේත්‍ර දහයක රූප ලබා ගන්නා ලද අතර, අතිරේක ක්‍රම 3 හි විස්තර කර ඇති පරාමිතීන්ට අනුව ImageJ මෘදුකාංගය (v1.54d) [30, 31] භාවිතයෙන් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රූප විද්‍යාත්මක විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
සෛල 0.1 M පොස්පේට් බෆරයේ 2% ග්ලූටරල්ඩිහයිඩ් සමඟ සවි කරන ලද අතර, පසුව 1% ඔස්මියම් ටෙට්‍රොක්සයිඩ් ද්‍රාවණයකින් (සිග්මා ඇල්ඩ්‍රිච්, MO, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සවි කරන ලදී, ක්‍රමයෙන් ඇසිටෝන් (මර්ක්, ඩාර්ම්ස්ටැඩ්, ජර්මනිය) සමඟ විජලනය කරන ලදී, අවසානයේ ඉෙපොක්සි ෙරසින් තුළට කාවැද්දන ලදී. අල්ට්‍රා තුනී කොටස් සකස් කර 1% යුරේනයිල් ඇසිටේට් (මර්ක්, ඩාර්ම්ස්ටැඩ්, ජර්මනිය) සහ 1% ඊයම් සයිටේ්‍රට් (මර්ක්, ඩාර්ම්ස්ටැඩ්, ජර්මනිය) සමඟ පැල්ලම් කරන ලදී. 80 kV ක ත්වරණ වෝල්ටීයතාවයකින් JEM 2100F EXII සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂයක් (JEOL Ltd, ටෝකියෝ, ජපානය) භාවිතයෙන් අල්ට්‍රා ව්‍යුහාත්මක රූප ලබා ගන්නා ලදී.
පැය 24ක් IPA සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද LX-2 සෛලවල රූප විද්‍යාව, Zeiss ප්‍රතිලෝම ආලෝක අන්වීක්ෂයක් (Zeiss Axio Vert.A1 සහ AxioCam MRm, ජෙනා, ජර්මනිය) භාවිතයෙන් 50x විශාලනයකදී අදියර-විපරීත අන්වීක්ෂය මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
සායනික දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය හෝ මධ්‍යන්‍ය (අන්තර් කාර්තු පරාසය: IQR) ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලදී. අධ්‍යයන කණ්ඩායම් තුන අතර වෙනස්කම් සංසන්දනය කිරීම සඳහා විචලනය පිළිබඳ ඒක-මාර්ග විශ්ලේෂණය (අඛණ්ඩ විචල්‍යයන්) හෝ χ² පරීක්ෂණය (වර්ගීකරණ විචල්‍යයන්) භාවිතා කරන ලදී. බහු පරීක්ෂණ සඳහා නිවැරදි කිරීම සඳහා ව්‍යාජ ධනාත්මක අනුපාතය (FDR) භාවිතා කරන ලද අතර, FDR < 0.05 සහිත ජාන සංඛ්‍යානමය වශයෙන් වැදගත් යැයි සැලකේ. නාමික p අගයන් (p < 0.05) වාර්තා කර ඇති පරිදි, CpG DNA මෙතිලේෂන් IPA සංඥා තීව්‍රතාවය සමඟ සහසම්බන්ධ කිරීමට ස්පියර්මන් සහසම්බන්ධතා විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී.
සංසරණය වන සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධ වූ අක්මා පිටපත් 3093 න් 4350 CpGs (නාමික p < 0.01), මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත පිටපත් 268 (නාමික p < 0.05) සහ 4350 CpGs සඳහා වෙබ් පාදක ජාන කට්ටල විශ්ලේෂණ මෙවලමක් (WebGestalt) භාවිතයෙන් මාර්ග විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. අතිච්ඡාදනය වන ජාන සොයා ගැනීමට නොමිලේ ලබා ගත හැකි Venny DB (අනුවාදය 2.1.0) මෙවලම භාවිතා කරන ලද අතර, ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා දෘශ්‍යමාන කිරීමට StringDB (අනුවාදය 11.5) භාවිතා කරන ලදී.
LX-2 අත්හදා බැලීම සඳහා, D'Agostino-Pearson පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සාම්පල සාමාන්‍යභාවය සඳහා පරීක්ෂා කරන ලදී. අවම වශයෙන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ තුනකින් දත්ත ලබා ගන්නා ලද අතර Bonferroni පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය සමඟ ඒකපාර්ශ්වික ANOVA වලට භාජනය කරන ලදී. 0.05 ට අඩු p-අගය සංඛ්‍යානමය වශයෙන් වැදගත් යැයි සැලකේ. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD ලෙස ඉදිරිපත් කර ඇති අතර, එක් එක් රූපයේ අත්හදා බැලීම් ගණන දක්වා ඇත. සියලුම විශ්ලේෂණ සහ ප්‍රස්ථාර Windows සඳහා GraphPad Prism 8 සංඛ්‍යානමය මෘදුකාංග භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී (GraphPad Software Inc., අනුවාදය 8.4.3, San Diego, USA).
පළමුව, අපි සෙරුම් IPA මට්ටම් අක්මාව, සම්පූර්ණ ශරීරය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පිටපත් සමඟ සම්බන්ධ කිරීම විමර්ශනය කළෙමු. සම්පූර්ණ පිටපත් පැතිකඩෙහි, සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධ වූ ශක්තිමත්ම ජානය MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; මයිටොජන්-සක්‍රිය කළ ප්‍රෝටීන් කයිනාස්-සක්‍රිය කළ ප්‍රෝටීන් කයිනාස් 3) විය; මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත පිටපත් පැතිකඩෙහි, ශක්තිමත්ම සම්බන්ධිත ජානය AKT1 (FDR = 0.7621; AKT සෙරීන්/ත්‍රෙයොනීන් කයිනාස් 1) (අතිරේක ගොනුව 1 සහ අතිරේක ගොනුව 2) විය.
ඉන්පසු අපි ගෝලීය පිටපත් (n = 268; p < 0.01) සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත පිටපත් (n = 119; p < 0.05) විශ්ලේෂණය කළ අතර, අවසානයේ ඇපොප්ටෝසිස් වඩාත් වැදගත් කැනොනිකල් මාර්ගය ලෙස හඳුනා ගත්තෙමු (p = 0.0089). සෙරුම් IPA මට්ටම් හා සම්බන්ධ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පිටපත් සඳහා, අපි ඇපොප්ටෝසිස් (FDR = 0.00001), මයිටොෆැජි (FDR = 0.00029) සහ TNF සංඥා මාර්ග (FDR = 0.000006) කෙරෙහි අවධානය යොමු කළෙමු (රූපය 1A, වගුව 2, සහ අතිරේක රූප 1A-B).
සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධ වී මිනිස් අක්මාවේ ගෝලීය, මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත පිටපත් සහ DNA මෙතිලේෂන් පිළිබඳ අතිච්ඡාදනය විශ්ලේෂණය. A යනු සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධ CpG අඩවි 3092 කට සිතියම්ගත කර ඇති ගෝලීය පිටපත් 268 ක්, මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත පිටපත් 119 ක් සහ DNA මෙතිලේටඩ් පිටපත් නියෝජනය කරයි (ගෝලීය පිටපත් සහ DNA මෙතිලේටඩ් සඳහා p අගයන් <0.01, සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා පිටපත් සඳහා p අගයන් <0.05). ප්‍රධාන අතිච්ඡාදනය වන පිටපත් මැදින් දක්වා ඇත (AKT1 සහ YKT6). B අනෙකුත් ජාන සමඟ ඉහළම අන්තර්ක්‍රියා ලකුණු (0.900) සහිත ජාන 13 හි අන්තර්ක්‍රියා සිතියම StringDB මාර්ගගත මෙවලම භාවිතයෙන් සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සැලකිය යුතු ලෙස සම්බන්ධ වූ අතිච්ඡාදනය වන ජාන 56 (කළු රේඛා කලාපය) වලින් ගොඩනගා ඇත. කොළ: ජාන ඔන්ටොලොජි (GO) සෛලීය සංරචකයට සිතියම්ගත කරන ලද ජාන: මයිටොකොන්ඩ්‍රියා (GO:0005739). AKT1 යනු දත්ත මත පදනම්ව (පෙළ කැණීම, අත්හදා බැලීම්, දත්ත සමුදායන් සහ සම-ප්‍රකාශනය මත පදනම්ව) අනෙකුත් ප්‍රෝටීන සමඟ අන්තර්ක්‍රියා සඳහා ඉහළම ලකුණු (0.900) සහිත ප්‍රෝටීනයයි. ජාල නෝඩ් ප්‍රෝටීන නියෝජනය කරන අතර දාර ප්‍රෝටීන අතර සම්බන්ධතා නියෝජනය කරයි.
බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවලට DNA මෙතිලේෂන් හරහා එපිජෙනටික් සංයුතිය නියාමනය කළ හැකි බැවින් [32], සෙරුම් IPA මට්ටම් අක්මා DNA මෙතිලේෂන් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇත්දැයි අපි විමර්ශනය කළෙමු. සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධ ප්‍රධාන මෙතිලේෂන් ස්ථාන දෙක ප්‍රෝලීන්-සෙරීන් බහුල කලාපය 3 (C19orf55) සහ තාප කම්පන ප්‍රෝටීන් පවුලේ B (කුඩා) සාමාජික 6 (HSPB6) අසල ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (අතිරේක ගොනුව 3). 4350 CpG (p < 0.01) හි DNA මෙතිලේෂන් සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ සහසම්බන්ධ වූ අතර දීර්ඝායුෂ නියාමන මාර්ග වලින් පොහොසත් විය (p = 0.006) (රූපය 1A, වගුව 2, සහ අතිරේක රූපය 1C).
මිනිස් අක්මාවේ සෙරුම් IPA මට්ටම්, ගෝලීය පිටපත්, මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත පිටපත් සහ DNA මෙතිලේෂන් අතර සම්බන්ධතාවලට යටින් පවතින ජීව විද්‍යාත්මක යාන්ත්‍රණයන් තේරුම් ගැනීම සඳහා, අපි පෙර මාර්ග විශ්ලේෂණයේදී හඳුනාගත් ජානවල අතිච්ඡාදනය විශ්ලේෂණයක් සිදු කළෙමු (රූපය 1A). අතිච්ඡාදනය වන ජාන 56 (රූපය 1A හි කළු රේඛාව ඇතුළත) මාර්ග පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ ඇපොප්ටෝසිස් මාර්ගය (p = 0.00029) විශ්ලේෂණ තුනට පොදු ජාන දෙකක් ඉස්මතු කර ඇති බවයි: වෙන් රූප සටහනේ (පරිපූරක රූපය 2 සහ රූපය 1A) පෙන්වා ඇති පරිදි AKT1 සහ YKT6 (YKT6 v-SNARE සමජාතීය). සිත්ගන්නා කරුණ නම්, AKT1 (cg19831386) සහ YKT6 (cg24161647) සෙරුම් IPA මට්ටම් සමඟ ධනාත්මකව සහසම්බන්ධ වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (අතිරේක ගොනුව 3). ජාන නිෂ්පාදන අතර විභව ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා හඳුනා ගැනීම සඳහා, අපි ආදානය ලෙස අතිච්ඡාදනය වන ජාන 56 ක් අතරින් ඉහළම පොදු කලාප ලකුණු (0.900) සහිත ජාන 13 ක් තෝරාගෙන අන්තර්ක්‍රියා සිතියමක් ගොඩනඟා ගත්තෙමු. විශ්වාසනීය මට්ටම (ආන්තික විශ්වාසය) අනුව, ඉහළම ලකුණු (0.900) සහිත AKT1 ජානය ඉහළින්ම තිබුණි (රූපය 1B).
මාර්ග විශ්ලේෂණය මත පදනම්ව, ඇපොප්ටෝසිස් ප්‍රධාන මාර්ගය බව අපට සොයා ගැනීමට හැකි විය, එබැවින් IPA ප්‍රතිකාරය HSCs in vitro හි ඇපොප්ටෝසිස් වලට බලපාන්නේද යන්න අපි විමර්ශනය කළෙමු. IPA හි විවිධ මාත්‍රා (10 μM, 100 μM, සහ 1 mM) LX-2 සෛල වලට විෂ නොවන බව අපි කලින් පෙන්නුම් කළෙමු [15]. මෙම අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ 10 μM සහ 100 μM හි IPA ප්‍රතිකාරය ශක්‍ය සහ නෙරෝටික් සෛල ගණන වැඩි කළ බවයි. කෙසේ වෙතත්, පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට, සෛල ශක්‍යතාව 1 mM IPA සාන්ද්‍රණයේදී අඩු වූ අතර, සෛල නෙරෝසිස් අනුපාතය නොවෙනස්ව පැවතුනි (රූපය 2A, B). ඊළඟට, LX-2 සෛලවල ඇපොප්ටෝසිස් ඇති කිරීමට ප්‍රශස්ත සාන්ද්‍රණය සොයා ගැනීමට, අපි පැය 24 ක් සඳහා 10 μM, 100 μM සහ 1 mM IPA පරීක්ෂා කළෙමු (රූපය 2A-E සහ අතිරේක රූපය 3A-B). සිත්ගන්නා කරුණ නම්, IPA 10 μM සහ 100 μM ඇපොප්ටෝසිස් අනුපාතය (%) අඩු කළ අතර, කෙසේ වෙතත්, IPA 1 mM පාලනයට සාපේක්ෂව ප්‍රමාද වූ ඇපොප්ටෝසිස් සහ ඇපොප්ටෝසිස් අනුපාතය (%) වැඩි කළ අතර එම නිසා වැඩිදුර අත්හදා බැලීම් සඳහා තෝරා ගන්නා ලදී (රූප 2A–D).
IPA මගින් LX-2 සෛලවල ඇපොප්ටෝසිස් ඇති කරයි. ඇනෙක්සින් V සහ 7-AAD ද්විත්ව පැල්ලම් කිරීමේ ක්‍රමය ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රිය මගින් ඇපොප්ටෝටික් අනුපාතය සහ සෛල රූප විද්‍යාව ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. BA සෛල පැය 24 ක් සඳහා 10 μM, 100 μM සහ 1 mM IPA සමඟ හෝ පැය 24 ක් සඳහා සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයේ F–H TGF-β1 (5 ng/ml) සහ 1 mM IPA සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. A: ජීව සෛල (ඇනෙක්සින් V -/ 7AAD-); B: නෙක්‍රොටික් සෛල (ඇනෙක්සින් V -/ 7AAD+); C, F: මුල් (ඇනෙක්සින් V +/ 7AAD-); D, G: ප්‍රමාද (ඇනෙක්සින් V+/7AAD.+); E, H: ඇපොප්ටෝටික් අනුපාතයේ මුළු මුල් සහ ප්‍රමාද ඇපොප්ටෝටික් සෛලවල ප්‍රතිශතය (%). දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD, n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක් ලෙස ප්‍රකාශ වේ. බොන්ෆෙරෝනි පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය සමඟ ඒකපාර්ශ්වික ANOVA භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය සංසන්දනයන් සිදු කරන ලදී. *p < 0.05; ****p < 0.0001
අප කලින් පෙන්වා දී ඇති පරිදි, 5 ng/ml TGF-β1 සම්භාව්‍ය සලකුණු ජානවල ප්‍රකාශනය වැඩි කිරීමෙන් HSC සක්‍රිය කිරීම ඇති කළ හැකිය [15]. LX-2 සෛල 5 ng/ml TGF-β1 සහ 1 mM IPA සමඟ ඒකාබද්ධව ප්‍රතිකාර කරන ලදී (රූපය 2E–H). TGF-β1 ප්‍රතිකාරය ඇපොප්ටෝසිස් අනුපාතය වෙනස් කළේ නැත, කෙසේ වෙතත්, TGF-β1 ප්‍රතිකාරයට සාපේක්ෂව IPA සම-ප්‍රතිකාරය ප්‍රමාද ඇපොප්ටෝසිස් සහ ඇපොප්ටෝසිස් අනුපාතය (%) වැඩි කළේය (රූපය 2E–H). මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ TGF-β1 ප්‍රේරණයෙන් ස්වාධීනව LX-2 සෛල තුළ ඇපොප්ටෝසිස් ප්‍රවර්ධනය කිරීමට 1 mM IPA හට හැකි බවයි.
LX-2 සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනය කෙරෙහි IPA හි බලපෑම අපි තවදුරටත් විමර්ශනය කළෙමු. ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ 1 mM IPA ඔක්සිජන් පරිභෝජන අනුපාතය (OCR) පරාමිතීන් අඩු කළ බවයි: පාලන කණ්ඩායමට සාපේක්ෂව මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් නොවන ශ්වසනය, බාසල් සහ උපරිම ශ්වසනය, ප්‍රෝටෝන කාන්දුව සහ ATP නිෂ්පාදනය (රූපය 3A, B), ජෛව ශක්තිජනක සෞඛ්‍ය දර්ශකය (BHI) වෙනස් නොවීය.
LX-2 සෛලවල IPA මගින් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනය අඩු කරයි. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසන වක්‍රය (OCR) මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසන පරාමිතීන් (මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් නොවන ශ්වසනය, බාසල් ශ්වසනය, උපරිම ශ්වසනය, ප්‍රෝටෝන කාන්දුව, ATP උත්පාදනය, SRC සහ BHI) ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ. A සහ ​​B සෛල පිළිවෙලින් පැය 24ක් සඳහා 10 μM, 100 μM සහ 1 mM IPA සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. C සහ D සෛල පිළිවෙලින් පැය 24ක් සඳහා සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයේ TGF-β1 (5 ng/ml) සහ 1 mM IPA සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. සියලුම මිනුම් CyQuant කට්ටලය භාවිතයෙන් DNA අන්තර්ගතයට සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී. BHI: ජෛව ශක්තිජනක සෞඛ්‍ය දර්ශකය; SRC: ශ්වසන සංචිත ධාරිතාව; OCR: ඔක්සිජන් පරිභෝජන අනුපාතය. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය (SD), n = 5 ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ. ඒක-මාර්ග ANOVA සහ Bonferroni පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය සැසඳීම් සිදු කරන ලදී. *p < 0.05; **p < 0.01; සහ ***p < 0.001
TGF-β1-සක්‍රිය LX-2 සෛලවල ජෛව ශක්තිජනක පැතිකඩට IPA හි බලපෑම පිළිබඳ වඩාත් පුළුල් අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා, අපි OCR මගින් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඔක්සිකාරක පොස්පරීකරණය විශ්ලේෂණය කළෙමු (රූපය 3C,D). ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී ගියේ TGF-β1 ප්‍රතිකාරය පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට උපරිම ශ්වසනය, ශ්වසන සංචිත ධාරිතාව (SRC) සහ BHI අඩු කළ හැකි බවයි (රූපය 3C,D). ඊට අමතරව, සංයෝජන ප්‍රතිකාරය බාසල් ශ්වසනය, ප්‍රෝටෝන කාන්දුව සහ ATP නිෂ්පාදනය අඩු කළ නමුත් SRC සහ BHI TGF-β1 සමඟ ප්‍රතිකාර කළ ඒවාට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 3C,D).
අපි සීහෝර්ස් මෘදුකාංගය මගින් සපයන ලද “සෛලීය ශක්ති ෆීනෝටයිප් පරීක්ෂණය” ද සිදු කළෙමු (පරිපූරක රූපය 4A–D). අතිරේක රූපය 3B හි පෙන්වා ඇති පරිදි, TGF-β1 ප්‍රතිකාරයෙන් පසු OCR සහ ECAR පරිවෘත්තීය විභවයන් දෙකම අඩු විය, කෙසේ වෙතත්, පාලන කණ්ඩායමට සාපේක්ෂව සංයෝජනය සහ IPA ප්‍රතිකාර කණ්ඩායම්වල කිසිදු වෙනසක් දක්නට නොලැබුණි. තවද, පාලන කණ්ඩායමට සාපේක්ෂව සංයෝජනය සහ IPA ප්‍රතිකාරයෙන් පසු OCR හි බාසල් සහ ආතති මට්ටම් දෙකම අඩු විය (පරිපූරක රූපය 4C). සිත්ගන්නා කරුණ නම්, සංයෝජන චිකිත්සාව සමඟ සමාන රටාවක් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, එහිදී TGF-β1 ප්‍රතිකාරයට සාපේක්ෂව ECAR හි බාසල් සහ ආතති මට්ටම්වල කිසිදු වෙනසක් දක්නට නොලැබුණි (පරිපූරක රූපය 4C). HSC වල, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඔක්සිකාරක පොස්පරීකරණය අඩු වීම සහ TGF-β1 ප්‍රතිකාරයට නිරාවරණය වීමෙන් පසු SCR සහ BHI යථා තත්ත්වයට පත් කිරීමට සංයෝජන ප්‍රතිකාරයේ හැකියාව පරිවෘත්තීය විභවය (OCR සහ ECAR) වෙනස් කළේ නැත. එකට ගත් කල, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ IPA මගින් HSC වල ජෛව ශක්තිජනක බව අඩු කළ හැකි බවයි, එයින් ඇඟවෙන්නේ IPA මගින් HSC ෆීනෝටයිප් අක්‍රිය වීම දෙසට මාරු කරන අඩු ශක්තිජනක පැතිකඩක් ඇති කළ හැකි බවයි (පරිපූරක රූපය 4D).
මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකය මත IPA හි බලපෑම, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රූප විද්‍යාව සහ ජාල සම්බන්ධතා මෙන්ම MTR පැල්ලම් කිරීමේ ත්‍රිමාණ ප්‍රමාණකරණය භාවිතයෙන් විමර්ශනය කරන ලදී (රූපය 4 සහ අතිරේක රූපය 5). රූප සටහන 4 පෙන්නුම් කරන්නේ, පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට, TGF-β1 ප්‍රතිකාරය සාමාන්‍ය මතුපිට ප්‍රදේශය, ශාඛා අංකය, මුළු ශාඛා දිග සහ ශාඛා හන්දි අංකය (රූපය 4A සහ B) අඩු කර ගෝලාකාර සිට අතරමැදි රූප විද්‍යාව දක්වා මයිටොකොන්ඩ්‍රියා අනුපාතය වෙනස් කළ බවයි (රූපය 4C). IPA ප්‍රතිකාරය පමණක් මධ්‍යන්‍ය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පරිමාව අඩු කළ අතර පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට ගෝලාකාර සිට අතරමැදි රූප විද්‍යාව දක්වා මයිටොකොන්ඩ්‍රියා අනුපාතය වෙනස් කළේය (රූපය 4A). ඊට වෙනස්ව, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පටල විභවය මත යැපෙන MTR (රූපය 4A සහ E) මගින් තක්සේරු කරන ලද ගෝලාකාරත්වය, මධ්‍යන්‍ය ශාඛා දිග සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරකම් නොවෙනස්ව පැවති අතර මෙම පරාමිතීන් කණ්ඩායම් අතර වෙනස් නොවීය. එකට ගත් විට, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ TGF-β1 සහ IPA ප්‍රතිකාරය සජීවී LX-2 සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් හැඩය සහ ප්‍රමාණය මෙන්ම ජාල සංකීර්ණතාව මොඩියුලේට් කරන බව පෙනේ.
LX-2 සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකත්වය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA බහුලත්වය IPA වෙනස් කරයි. A. සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයේ පැය 24 ක් සඳහා TGF-β1 (5 ng/ml) සහ 1 mM IPA සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද සජීවී LX-2 සෛලවල නියෝජිත සංජානන රූප, Mitotracker™ Red CMXRos සමඟ පැල්ලම් සහිත මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාල සහ DAPI සමඟ නිල් පැහැයෙන් වර්ණ ගැන්වූ න්‍යෂ්ටීන් පෙන්වයි. සියලුම දත්ත කාණ්ඩයකට අවම වශයෙන් රූප 15 ක් අඩංගු විය. අපි එක් එක් සාම්පල වර්ගය සඳහා Z-ස්ටැක් රූප 10 ක් ලබා ගත්තෙමු. සෑම Z-අක්ෂ අනුපිළිවෙලකම 9.86 μm ඝණකම සහිත පෙති 30 ක් අඩංගු විය. පරිමාණ තීරුව: 10 μm. B. රූපයට අනුවර්තන එළිපත්ත යෙදීමෙන් හඳුනාගත් නියෝජිත වස්තූන් (මයිටොකොන්ඩ්‍රියා පමණි). සෑම කාණ්ඩයකම සියලුම සෛල සඳහා මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රූප විද්‍යාත්මක ජාල සම්බන්ධතා ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය සහ සංසන්දනය සිදු කරන ලදී. C. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් හැඩ අනුපාතවල සංඛ්‍යාතය. 0 ට ආසන්න අගයන් ගෝලාකාර හැඩතල පෙන්නුම් කරන අතර 1 ට ආසන්න අගයන් සූතිකාමය හැඩතල දක්වයි. D මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA (mtDNA) අන්තර්ගතය ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි තීරණය කරන ලදී. E Mitotracker™ Red CMXRos විශ්ලේෂණය ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි ප්‍රවාහ සයිටෝමෙට්‍රි (සිදුවීම් 30,000) මගින් සිදු කරන ලදී. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD, n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක් ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ. ඒක-මාර්ග ANOVA සහ Bonferroni පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය සංසන්දනයන් සිදු කරන ලදී. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
ඉන්පසු අපි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අංකයේ දර්ශකයක් ලෙස LX-2 සෛලවල mtDNA අන්තර්ගතය විශ්ලේෂණය කළෙමු. පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට, TGF-β1-ප්‍රතිකාර කළ කණ්ඩායමේ mtDNA අන්තර්ගතය වැඩි විය (රූපය 4D). TGF-β1-ප්‍රතිකාර කළ කණ්ඩායම හා සසඳන විට, සංයෝජන ප්‍රතිකාර කණ්ඩායමේ mtDNA අන්තර්ගතය අඩු විය (රූපය 4D), IPA මඟින් mtDNA අන්තර්ගතය සහ සමහර විට මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අංකය මෙන්ම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනයද අඩු කළ හැකි බව යෝජනා කළේය (රූපය 3C). එපමණක් නොව, IPA සංයෝජන ප්‍රතිකාරයේදී mtDNA අන්තර්ගතය අඩු කරන බවක් පෙනෙන්නට තිබුණත් MTR-මැදිහත් වූ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වයට එය බලපා නැත (රූපය 4A-C).
LX-2 සෛලවල ෆයිබ්‍රෝසිස්, ඇපොප්ටෝසිස්, පැවැත්ම සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකත්වයට සම්බන්ධ ජානවල mRNA මට්ටම් සමඟ IPA සම්බන්ධය අපි විමර්ශනය කළෙමු (රූපය 5A–D). පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට, TGF-β1-ප්‍රතිකාර කළ කණ්ඩායම කොලජන් වර්ගයේ I α2 දාමය (COL1A2), α-සුමට මාංශ පේශි ඇක්ටින් (αSMA), මැට්‍රික්ස් මෙටලෝප්‍රෝටීනේස් 2 (MMP2), මෙටලෝප්‍රෝටීනේස් 1 හි පටක නිෂේධකය (TIMP1) සහ ඩයිනමින් 1-සමාන ජානය (DRP1) වැනි ජානවල වැඩි ප්‍රකාශනයක් පෙන්නුම් කළ අතර එය ෆයිබ්‍රෝසිස් සහ සක්‍රිය කිරීම වැඩි කරන බව පෙන්නුම් කරයි. තවද, පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට, TGF-β1 ප්‍රතිකාරය න්‍යෂ්ටික ගර්භනී X ප්‍රතිග්‍රාහකයේ (PXR), කැස්පේස් 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-සෛල α හි නිෂේධකය, න්‍යෂ්ටික සාධකය κ ජාන ආලෝක පෙප්ටයිඩයේ (NFκB1A) වැඩි දියුණු කරන්නා සහ න්‍යෂ්ටික සාධකය κB කයිනේස් උප ඒකකය β (IKBKB) නිෂේධකයේ mRNA මට්ටම් අඩු කළේය (රූපය 5A–D). TGF-β1 ප්‍රතිකාරය හා සසඳන විට, TGF-β1 සහ IPA සමඟ ඒකාබද්ධ ප්‍රතිකාරය COL1A2 සහ MMP2 ප්‍රකාශනය අඩු කළ නමුත් PXR, TIMP1, B-සෛල ලිම්ෆෝමා-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, සහ IKBKB වල mRNA මට්ටම් වැඩි කළේය. IPA ප්‍රතිකාරය MMP2, Bcl-2-ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් X (BAX), AKT1, දෘෂ්ටි ක්ෂය වීමේ ප්‍රෝටීන් 1 (OPA1) සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විලයන ප්‍රෝටීන් 2 (MFN2) ප්‍රකාශනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළ අතර, CASP8, NFκB1A, NFκB1B, සහ IKBKB ප්‍රකාශනය පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට වැඩි විය. කෙසේ වෙතත්, කැස්පේස්-3 (CASP3), ඇපොප්ටොටික් පෙප්ටයිඩේස් සක්‍රිය කිරීමේ සාධකය 1 (APAF1), මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විලයන ප්‍රෝටීන් 1 (MFN1) සහ විඛණ්ඩන ප්‍රෝටීන් 1 (FIS1) ප්‍රකාශනයේ කිසිදු වෙනසක් දක්නට නොලැබුණි. සාමූහිකව, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ IPA ප්‍රතිකාරය ෆයිබ්‍රෝසිස්, ඇපොප්ටෝසිස්, පැවැත්ම සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකත්වය සමඟ සම්බන්ධ ජානවල ප්‍රකාශනය මොඩියුලේට් කරන බවයි. අපගේ දත්තවලින් පෙනී යන්නේ IPA ප්‍රතිකාරය LX-2 සෛලවල ෆයිබ්‍රෝසිස් අඩු කරන බවයි; ඒ සමඟම, එය ෆීනෝටයිප් අක්‍රිය වීම දෙසට මාරු කිරීමෙන් පැවැත්ම උත්තේජනය කරයි.
LX-2 සෛලවල ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට්, ඇපොප්ටෝටික්, ශක්‍යතාව සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතික ජානවල ප්‍රකාශනය IPA මොඩියුලේට් කරයි. පැය 24ක් සඳහා සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයේ TGF-β1 සහ IPA සමඟ LX-2 සෛල ප්‍රේරණය කිරීමෙන් පසු අන්තරාසර්ග පාලනයට (RPLP0 හෝ PPIA) සාපේක්ෂව හිස්ටෝග්‍රෑම් mRNA ප්‍රකාශනය පෙන්වයි. A මඟින් ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් පෙන්නුම් කරයි, B මඟින් ඇපොප්ටෝටික් සෛල දක්වයි, C මඟින් දිවි ගලවා ගත් සෛල දක්වයි, සහ D මඟින් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතික ජාන ප්‍රකාශනය දක්වයි. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය (SD) ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ, n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක්. ඒක-මාර්ග ANOVA සහ Bonferroni පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය සංසන්දනයන් සිදු කරන ලදී. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
ඉන්පසුව, සෛල ප්‍රමාණයේ (FSC-H) සහ සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතාවයේ (SSC-H) වෙනස්කම් ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මගින් තක්සේරු කරන ලද අතර, IPA ප්‍රතිකාරයෙන් පසු සෛල රූප විද්‍යාවේ වෙනස්කම් සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂය (TEM) සහ අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධ අන්වීක්ෂය මගින් තක්සේරු කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 6A-B). අපේක්ෂා කළ පරිදි, TGF-β1-ප්‍රතිකාර කළ කණ්ඩායමේ සෛල පාලන කණ්ඩායමට සාපේක්ෂව ප්‍රමාණයෙන් වැඩි විය (රූපය 6A,B), රළු එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් (ER*) සහ ෆාගොලිසොසෝම (P) වල සම්භාව්‍ය ප්‍රසාරණය පෙන්නුම් කරමින්, රක්තපාත කඳ සෛල (HSC) සක්‍රිය කිරීම පෙන්නුම් කරයි (පරිපූරක රූපය 6A). කෙසේ වෙතත්, TGF-β1-ප්‍රතිකාර කළ කණ්ඩායම හා සසඳන විට, TGF-β1 සහ IPA සංයෝජන ප්‍රතිකාර කණ්ඩායමේ සෛල ප්‍රමාණය, සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතාව (රූපය 6A,B) සහ ER* අන්තර්ගතය අඩු විය (පරිපූරක රූපය 6A). තවද, IPA ප්‍රතිකාරය පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට සෛල ප්‍රමාණය, සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතාව (රූප 6A,B), P සහ ER* අන්තර්ගතය (පරිපූරක රූපය 6A) අඩු කළේය. ඊට අමතරව, පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට IPA ප්‍රතිකාරයෙන් පැය 24 කට පසු ඇපොප්ටෝටික් සෛලවල අන්තර්ගතය වැඩි විය (සුදු ඊතල, පරිපූරක රූපය 6B). සාමූහිකව, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ 1 mM IPA හට HSC ඇපොප්ටෝසිස් උත්තේජනය කළ හැකි අතර TGF-β1 මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද සෛල රූප විද්‍යාත්මක පරාමිතීන්හි වෙනස්කම් ආපසු හැරවිය හැකි බවත්, එමඟින් HSC අක්‍රිය වීම සමඟ සම්බන්ධ විය හැකි සෛල ප්‍රමාණය සහ සංකීර්ණතාව නියාමනය කළ හැකි බවත්ය.
LX-2 සෛලවල සෛල ප්‍රමාණය සහ සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතාව IPA වෙනස් කරයි. ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි විශ්ලේෂණයේ නියෝජිත රූප. විශ්ලේෂණය LX-2 සෛල සඳහා විශේෂිත වූ ගේටින් උපාය මාර්ගයක් භාවිතා කළේය: සෛල ජනගහනය නිර්වචනය කිරීමට SSC-A/FSC-A, ද්විත්ව හඳුනා ගැනීමට FSC-H/FSC-A, සහ සෛල ප්‍රමාණය සහ සංකීර්ණතා විශ්ලේෂණය සඳහා SSC-H/FSC-H. පැය 24 ක් සඳහා සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයේ TGF-β1 (5 ng/ml) සහ 1 mM IPA සමඟ සෛල පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. LX-2 සෛල පහළ වම් චතුරස්‍රය (SSC-H-/FSC-H-), ඉහළ වම් චතුරස්‍රය (SSC-H+/FSC-H-), පහළ දකුණු චතුරස්‍රය (SSC-H-/FSC-H+) සහ ඉහළ දකුණු චතුරස්‍රය (SSC-H+/FSC-H+) ලෙස සෛල ප්‍රමාණය සහ සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතා විශ්ලේෂණය සඳහා බෙදා හරින ලදී. B. සෛල රූප විද්‍යාව FSC-H (ඉදිරි විසරණය, සෛල ප්‍රමාණය) සහ SSC-H (පැති විසරණය, සයිටොප්ලාස්මික් සංකීර්ණතාව) (30,000 සිදුවීම්) භාවිතයෙන් ප්‍රවාහ සයිටොමෙට්‍රි මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD, n = ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 ක් ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ. ඒකපාර්ශ්වික ANOVA සහ Bonferroni පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය සංසන්දනයන් සිදු කරන ලදී. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 සහ ****p < 0.0001
IPA වැනි බඩවැල් පරිවෘත්තීය පර්යේෂණයේ උණුසුම් මාතෘකාවක් බවට පත්ව ඇති අතර, එයින් ඇඟවෙන්නේ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවයේ නව ඉලක්ක සොයා ගත හැකි බවයි. එබැවින් මිනිසුන් තුළ අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් සමඟ අප සම්බන්ධ කර ඇති පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයක් වන IPA, සත්ව ආකෘතිවල විභව ප්‍රති-ෆයිබ්‍රෝටික් සංයෝගයක් බව පෙන්වා දී තිබීම සිත්ගන්නා කරුණකි [15]. මෙහිදී, අපි පළමු වරට සෙරුමය IPA සහ ගෝලීය අක්මා ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටොමික්ස් සහ DNA මෙතිලේෂන් අතර සම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කරන අතර, දෙවන වර්ගයේ දියවැඩියාව (T2D) නොමැති තරබාරු පුද්ගලයින් තුළ, ඇපොප්ටෝසිස්, මයිටොෆැජි සහ දීර්ඝායුෂ මෙන්ම අක්මා හෝමියස්ටැසිස් නියාමනය කරන AKT1 විය හැකි අපේක්ෂක ජානයක් ඉස්මතු කරමු. අපගේ අධ්‍යයනයේ තවත් නව්‍යතාවයක් නම්, LX-2 සෛලවල ඇපොප්ටෝසිස්, සෛල රූප විද්‍යාව, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෛව ශක්ති විද්‍යාව සහ ගතිකත්වය සමඟ IPA ප්‍රතිකාරයේ අන්තර්ක්‍රියාව අපි පෙන්නුම් කළ අතර, එය HSC ෆීනෝටයිප් අක්‍රිය කිරීම දෙසට මාරු කරන අඩු ශක්ති වර්ණාවලියක් පෙන්නුම් කරමින්, IPA අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා විභව අපේක්ෂකයෙකු බවට පත් කරයි.
අපි සොයා ගත්තේ ඇපොප්ටෝසිස්, මයිටොෆැජි සහ දීර්ඝායුෂ යනු සෙරුමය IPA සංසරණය වීම හා සම්බන්ධ අක්මා ජාන වලින් පොහොසත් කරන ලද වැදගත්ම කැනොනිකල් මාර්ග බවයි. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් තත්ත්ව පාලන (MQC) පද්ධතිය කඩාකප්පල් කිරීම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාව, මයිටොෆැජි සහ ඇපොප්ටෝසිස් වලට හේතු විය හැකි අතර එමඟින් MASLD [33, 34] ඇතිවීම ප්‍රවර්ධනය කරයි. එබැවින්, අක්මාව තුළ ඇපොප්ටෝසිස්, මයිටොෆැජි සහ දීර්ඝායුෂ හරහා සෛල ගතිකත්වය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අඛණ්ඩතාව පවත්වා ගැනීමට IPA සම්බන්ධ විය හැකි බව අපට අනුමාන කළ හැකිය. අපගේ දත්ත මගින් පෙන්නුම් කළේ YKT6 සහ AKT1 යන පරීක්ෂණ තුන හරහා ජාන දෙකක් පොදු බවයි. YKT6 යනු සෛල පටල විලයන ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ වන SNARE ප්‍රෝටීනයක් බව සඳහන් කිරීම වටී. එය ස්වයංක්‍රීය භක්ෂක මත STX17 සහ SNAP29 සමඟ ආරම්භක සංකීර්ණයක් සෑදීමෙන් ස්වයංක්‍රීය භක්ෂක සහ මයිටොෆැජි වල කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි, එමඟින් ස්වයංක්‍රීය භක්ෂක සහ ලයිසොසෝම විලයනය ප්‍රවර්ධනය කරයි [35]. තවද, YKT6 ක්‍රියාකාරිත්වය නැතිවීම දුර්වල මයිටොෆැජි [36] වලට හේතු වන අතර, YKT6 ඉහළ නියාමනය හෙපටෝසෙලියුලර් පිළිකා (HCC) ප්‍රගතිය සමඟ සම්බන්ධ වන අතර, සෛල පැවැත්ම වැඩි වීම පෙන්නුම් කරයි [37]. අනෙක් අතට, AKT1 යනු වඩාත්ම වැදගත් අන්තර්ක්‍රියාකාරී ජානය වන අතර PI3K/AKT සංඥා මාර්ගය, සෛල චක්‍රය, සෛල සංක්‍රමණය, ප්‍රගුණනය, නාභිගත ඇලවීම, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය සහ කොලජන් ස්‍රාවය [38–40] ඇතුළු අක්මා රෝග සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. සක්‍රිය PI3K/AKT සංඥා මාර්ගයට බාහිර සෛල අනුකෘතිය (ECM) නිෂ්පාදනය සඳහා වගකිව යුතු සෛල වන රක්තපාත කඳ සෛල (HSCs) සක්‍රිය කළ හැකි අතර, එහි අක්‍රමිකතාව අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ඇතිවීම හා ප්‍රගතියට දායක විය හැකිය [40]. ඊට අමතරව, AKT යනු p53 මත යැපෙන සෛල ඇපොප්ටෝසිස් වළක්වන ප්‍රධාන සෛල පැවැත්මේ සාධකවලින් එකක් වන අතර, AKT සක්‍රිය කිරීම අක්මා සෛල ඇපොප්ටෝසිස් නිෂේධනය සමඟ සම්බන්ධ විය හැකිය [41, 42]. ලබාගත් ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ IPA අක්මාවේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ආශ්‍රිත ඇපොප්ටෝසිස් වලට සම්බන්ධ වී හෙපටෝසයිට් ඇපොප්ටෝසිස් වලට ඇතුළු වීම හෝ පැවැත්ම අතර තීරණයට බලපෑම් කළ හැකි බවයි. මෙම බලපෑම් අක්මා හෝමියස්ටැසිස් සඳහා ඉතා වැදගත් වන AKT සහ/හෝ YKT6 අපේක්ෂක ජාන මගින් නියාමනය කළ හැකිය.
අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී ගියේ TGF-β1 ප්‍රතිකාරයෙන් ස්වාධීනව LX-2 සෛලවල 1 mM IPA ඇපොප්ටෝසිස් ඇති කළ අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනය අඩු කළ බවයි. ඇපොප්ටෝසිස් යනු ෆයිබ්‍රෝසිස් විභේදනය සහ රක්තපාත කඳ සෛල (HSC) සක්‍රිය කිරීම සඳහා ප්‍රධාන මාර්ගයක් වන අතර අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් හි ප්‍රතිවර්ත කළ හැකි භෞතික විද්‍යාත්මක ප්‍රතිචාරයේ ප්‍රධාන සිදුවීමක් ද වන බව සැලකිය යුතු කරුණකි [4, 43]. එපමණක් නොව, ඒකාබද්ධ ප්‍රතිකාරයෙන් පසු LX-2 සෛලවල BHI ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෛව ශක්ති නියාමනය කිරීමේදී IPA හි විභව භූමිකාව පිළිබඳ නව අවබෝධයක් ලබා දුන්නේය. විවේක හා අක්‍රිය තත්වයන් යටතේ, රක්තපාත සෛල සාමාන්‍යයෙන් ATP නිපදවීමට සහ අඩු පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරකම් ඇති කිරීමට මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඔක්සිකාරක පොස්පරීකරණය භාවිතා කරයි. අනෙක් අතට, HSC සක්‍රිය කිරීම ග්ලයිකොලිටික් තත්වයට ඇතුළු වීමේ ශක්ති ඉල්ලුමට වන්දි ගෙවීම සඳහා මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනය සහ ජෛව සංස්ලේෂණය වැඩි දියුණු කරයි [44]. IPA පරිවෘත්තීය විභවයට සහ ECAR වලට බල නොපා ඇති බව පෙන්නුම් කරන්නේ ග්ලයිකොලිටික් මාර්ගය අඩු ප්‍රමුඛතාවයක් ලබා දී ඇති බවයි. ඒ හා සමානව, තවත් අධ්‍යයනයකින් පෙන්නුම් කළේ 1 mM IPA මගින් හෘද සෛල, මානව හෙපටෝසයිට් සෛල රේඛාව (Huh7) සහ මානව පෙකණි නහර එන්ඩොතලියල් සෛල (HUVEC) වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසන දාම ක්‍රියාකාරිත්වය මොඩියුලේට් කිරීමට හැකි වූ බවයි; කෙසේ වෙතත්, හෘද සෛලවල ග්ලයිකොලිසිස් මත IPA හි කිසිදු බලපෑමක් දක්නට නොලැබුණු අතර, IPA අනෙකුත් සෛල වර්ගවල ජෛව ශක්ති විද්‍යාවට බලපෑම් කළ හැකි බව යෝජනා කරයි [45]. එබැවින්, 1 mM IPA මෘදු රසායනික uncoupler ලෙස ක්‍රියා කළ හැකි බව අපි අනුමාන කරමු, මන්ද එය mtDNA ප්‍රමාණය වෙනස් නොකර ෆයිබ්‍රොජනික් ජාන ප්‍රකාශනය, සෛල රූප විද්‍යාව සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෛව ශක්ති විද්‍යාව සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළ හැකිය [46]. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් uncouplers සංස්කෘතියෙන් ඇති කරන ලද ෆයිබ්‍රෝසිස් සහ HSC සක්‍රිය කිරීම වළක්වයි [47] සහ uncoupling ප්‍රෝටීන (UCP) හෝ ඇඩිනීන් නියුක්ලියෝටයිඩ ට්‍රාන්ස්ලොකේස් (ANT) වැනි ඇතැම් ප්‍රෝටීන මගින් නියාමනය කරන ලද හෝ ප්‍රේරණය කරන ලද මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ATP නිෂ්පාදනය අඩු කරයි. සෛල වර්ගය මත පදනම්ව, මෙම සංසිද්ධියට සෛල ඇපොප්ටෝසිස් වලින් ආරක්ෂා කිරීමට සහ/හෝ ඇපොප්ටෝසිස් ප්‍රවර්ධනය කිරීමට හැකිය [46]. කෙසේ වෙතත්, රක්තපාත කඳ සෛල අක්‍රිය කිරීමේදී මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විසන්ධි කරන්නෙකු ලෙස IPA හි කාර්යභාරය පැහැදිලි කිරීම සඳහා වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් අවශ්‍ය වේ.
ඉන්පසු අපි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශ්වසනයේ සිදුවන වෙනස්කම් සජීවී LX-2 සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රූප විද්‍යාවේ පිළිබිඹු වේද යන්න සොයා බැලුවෙමු. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, TGF-β1 ප්‍රතිකාරය ගෝලාකාර සිට අතරමැදි දක්වා මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අනුපාතය වෙනස් කරන අතර, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ශාඛා අඩුවීම සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විඛණ්ඩනයේ ප්‍රධාන සාධකයක් වන DRP1 හි ප්‍රකාශනය වැඩි වීමයි [48]. තවද, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඛණ්ඩනය සමස්ත ජාල සංකීර්ණතාව සමඟ සම්බන්ධ වන අතර, විලයනයෙන් විඛණ්ඩනයට සංක්‍රමණය වීම රක්තපාත කඳ සෛල (HSC) සක්‍රිය කිරීම සඳහා ඉතා වැදගත් වන අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විඛණ්ඩනය නිෂේධනය කිරීම HSC ඇපොප්ටෝසිස් වලට හේතු වේ [49]. මේ අනුව, අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ TGF-β1 ප්‍රතිකාරය ශාඛා අඩුවීමත් සමඟ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාල සංකීර්ණතාවයේ අඩුවීමක් ඇති කළ හැකි බවයි, එය සක්‍රිය රක්තපාත කඳ සෛල (HSCs) හා සම්බන්ධ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විඛණ්ඩනයේ බහුලව දක්නට ලැබේ. තවද, අපගේ දත්ත පෙන්වා දුන්නේ IPA මගින් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අනුපාතය ගෝලාකාර සිට අතරමැදි හැඩයට වෙනස් කළ හැකි බවත්, එමඟින් OPA1 සහ MFN2 ප්‍රකාශනය අඩු කළ හැකි බවත්ය. අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ OPA1 අඩු කිරීම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පටල විභවය අඩුවීමට සහ සෛල ඇපොප්ටෝසිස් අවුලුවාලීමට හේතු විය හැකි බවයි [50]. MFN2 මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විලයනය සහ ඇපොප්ටෝසිස් සඳහා මැදිහත් වන බව දන්නා කරුණකි[51]. ලබාගත් ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ TGF-β1 සහ/හෝ IPA මගින් LX-2 සෛල ප්‍රේරණය කිරීම මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් හැඩය සහ ප්‍රමාණය මෙන්ම සක්‍රිය කිරීමේ තත්ත්වය සහ ජාල සංකීර්ණතාව මොඩියුලේට් කරන බවයි.
අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ TGFβ-1 සහ IPA ඒකාබද්ධ ප්‍රතිකාරය මගින් ඇපොප්ටෝසිස්-මගහැර යන සෛලවල ෆයිබ්‍රෝසිස්, ඇපොප්ටෝසිස් සහ පැවැත්මට අදාළ ජානවල mRNA ප්‍රකාශනය නියාමනය කිරීමෙන් mtDNA සහ සෛල රූප විද්‍යාත්මක පරාමිතීන් අඩු කළ හැකි බවයි. ඇත්ත වශයෙන්ම, IPA මගින් AKT1 හි mRNA ප්‍රකාශන මට්ටම සහ COL1A2 සහ MMP2 වැනි වැදගත් ෆයිබ්‍රෝසිස් ජාන අඩු කළ නමුත් ඇපොප්ටෝසිස් සමඟ සම්බන්ධ වන CASP8 හි ප්‍රකාශන මට්ටම වැඩි කළේය. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී ගියේ IPA ප්‍රතිකාරයෙන් පසු, BAX ප්‍රකාශනය අඩු වූ බවත් TIMP1 පවුලේ උප ඒකක වන BCL-2 සහ NF-κB හි mRNA ප්‍රකාශනය වැඩි වූ බවත්, එමඟින් IPA මගින් ඇපොප්ටෝසිස් මග හැරෙන රක්තපාත කඳ සෛල (HSCs) තුළ පැවැත්මේ සංඥා උත්තේජනය කළ හැකි බවත්ය. මෙම අණු සක්‍රිය රක්තපාත කඳ සෛලවල පැවැත්මට පක්ෂපාතී සංඥා ලෙස ක්‍රියා කළ හැකි අතර, ඒවා ඇපොප්ටෝටික් විරෝධී ප්‍රෝටීන (Bcl-2 වැනි) වැඩි ප්‍රකාශනය, ඇපොප්ටෝටික් විරෝධී BAX ප්‍රකාශනය අඩු වීම සහ TIMP සහ NF-κB අතර සංකීර්ණ අන්තර් ක්‍රියාකාරිත්වයක් සමඟ සම්බන්ධ විය හැකිය [5, 7]. PXR හරහා IPA එහි බලපෑම් ක්‍රියාත්මක කරන අතර, TGF-β1 සහ IPA සමඟ ඒකාබද්ධ ප්‍රතිකාර මගින් HSC සක්‍රිය කිරීම මර්දනය කරන බව පෙන්නුම් කරමින් PXR mRNA ප්‍රකාශන මට්ටම් වැඩි කරන බව අපට පෙනී ගියේය. සක්‍රිය PXR සංඥා කිරීම vivo සහ in vitro යන දෙකෙහිම HSC සක්‍රිය වීම වළක්වන බව දන්නා කරුණකි [52, 53]. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ, IPA හට ඇපොප්ටෝසිස් ප්‍රවර්ධනය කිරීම, ෆයිබ්‍රෝසිස් සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පරිවෘත්තීය අඩු කිරීම සහ පැවැත්මේ සංඥා වැඩි දියුණු කිරීම මගින් සක්‍රිය HSC නිෂ්කාශනයට සහභාගී විය හැකි බවයි, ඒවා සක්‍රිය HSC ෆීනෝටයිප් අක්‍රිය එකක් බවට පරිවර්තනය කරන සාමාන්‍ය ක්‍රියාවලීන් වේ. ඇපොප්ටෝසිස් හි IPA හි විභව යාන්ත්‍රණය සහ භූමිකාව සඳහා තවත් විය හැකි පැහැදිලි කිරීමක් නම්, එය ප්‍රධාන වශයෙන් මයිටොෆැජි (අභ්‍යන්තර මාර්ගය) සහ බාහිර TNF සංඥා මාර්ගය (වගුව 1) හරහා අක්‍රිය මයිටොකොන්ඩ්‍රියාව ඉවත් කරන බවයි, එය NF-κB පැවැත්මේ සංඥා මාර්ගයට සෘජුවම සම්බන්ධ වේ (පරිපූරක රූපය 7). සිත්ගන්නා කරුණ නම්, IPA ආශ්‍රිත පොහොසත් ජානවලට ඇපොප්ටෝටික් මාර්ගයේදී [54] ඇපොප්ටෝටික් මාර්ගයට සහ පැවැත්මට ගැති සංඥා ඇති කිරීමට හැකි වන අතර, IPA මෙම ජාන සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කිරීමෙන් ඇපොප්ටෝටික් මාර්ගය හෝ පැවැත්මට ප්‍රේරණය කළ හැකි බව යෝජනා කරයි. කෙසේ වෙතත්, HSC සක්‍රිය කිරීමේදී IPA ඇපොප්ටෝසිස් හෝ පැවැත්ම ඇති කරන ආකාරය සහ එහි යාන්ත්‍රික මාර්ග තවමත් පැහැදිලි නැත.
IPA යනු ආහාරමය ට්‍රිප්ටෝෆාන් වලින් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවය හරහා සෑදෙන ක්ෂුද්‍රජීවී පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යයකි. එය බඩවැල් පරිසරයේ ප්‍රති-ගිනි අවුලුවන, ප්‍රතිඔක්සිකාරක සහ එපිජෙනටික් නියාමන ගුණ ඇති බව අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත.[55] IPA හට බඩවැල් බාධක ක්‍රියාකාරිත්වය මොඩියුලේට් කළ හැකි අතර ඔක්සිකාරක ආතතිය අඩු කළ හැකි බව අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇති අතර එය එහි දේශීය භෞතික විද්‍යාත්මක බලපෑම් වලට දායක විය හැකිය.[56] ඇත්ත වශයෙන්ම, IPA සංසරණය හරහා අවයව ඉලක්ක කර ගැනීමට ප්‍රවාහනය කරනු ලබන අතර, IPA ට්‍රිප්ටෝෆාන්, සෙරොටොනින් සහ ඉන්ඩෝල් ව්‍යුත්පන්නයන් සමඟ සමාන ප්‍රධාන පරිවෘත්තීය ව්‍යුහයක් බෙදා ගන්නා බැවින්, IPA තරඟකාරී පරිවෘත්තීය ඉරණමට හේතු වන පරිවෘත්තීය ක්‍රියා සිදු කරයි.[52] IPA එන්සයිම හෝ ප්‍රතිග්‍රාහක මත බන්ධන ස්ථාන සඳහා ට්‍රිප්ටෝෆාන්-ව්‍යුත්පන්න පරිවෘත්තීය සමඟ තරඟ කළ හැකි අතර, සාමාන්‍ය පරිවෘත්තීය මාර්ගවලට බාධා කළ හැකිය. එහි චිකිත්සක කවුළුව වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා එහි ඖෂධීය විද්‍යාව සහ ඖෂධීය ගති විද්‍යාව පිළිබඳ වැඩිදුර අධ්‍යයනයන්හි අවශ්‍යතාවය මෙය ඉස්මතු කරයි.[57] මෙය රක්තපාත කඳ සෛල (HSCs) තුළද සිදුවිය හැකිද යන්න තවමත් සොයා බැලිය යුතුය.
අපගේ අධ්‍යයනයට යම් සීමාවන් ඇති බව අපි පිළිගනිමු. IPA හා සම්බන්ධ සම්බන්ධතා විශේෂයෙන් පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි 2 වර්ගයේ දියවැඩියා රෝගය (T2DM) ඇති රෝගීන් බැහැර කළෙමු. මෙය 2 වර්ගයේ දියවැඩියා රෝගය සහ දියුණු අක්මා රෝග ඇති රෝගීන් සඳහා අපගේ සොයාගැනීම්වල පුළුල් අදාළත්වය සීමා කරන බව අපි පිළිගනිමු. මිනිස් සෙරුමයේ IPA හි භෞතික විද්‍යාත්මක සාන්ද්‍රණය 1–10 μM [11, 20] වුවද, ඉහළම විෂ නොවන සාන්ද්‍රණය [15] සහ ඉහළම ඇපොප්ටෝසිස් අනුපාතය මත පදනම්ව 1 mM IPA සාන්ද්‍රණයක් තෝරා ගන්නා ලදී, නෙක්‍රොටික් සෛල ජනගහනයේ ප්‍රතිශතයේ කිසිදු වෙනසක් නොමැතිව. මෙම අධ්‍යයනයේදී IPA හි අධි භෞතික විද්‍යාත්මක මට්ටම් භාවිතා කළද, IPA හි ඵලදායී මාත්‍රාව සම්බන්ධයෙන් දැනට එකඟතාවයක් නොමැත [52]. අපගේ ප්‍රතිඵල සැලකිය යුතු වුවද, IPA හි පුළුල් පරිවෘත්තීය ඉරණම පර්යේෂණයේ ක්‍රියාකාරී ක්ෂේත්‍රයක් ලෙස පවතී. එපමණක් නොව, සෙරුම් IPA මට්ටම් සහ අක්මා පිටපත් වල DNA මෙතිලේෂන් අතර සම්බන්ධය පිළිබඳ අපගේ සොයාගැනීම් රක්තපාත කඳ සෛල (HSCs) වලින් පමණක් නොව අක්මා පටක වලින් ද ලබා ගන්නා ලදී. IPA රක්තපාත කඳ සෛල (HSC) සක්‍රිය කිරීම සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බවත්, HSCs අක්මා ෆයිබ්‍රෝසිස් ප්‍රගතියට සම්බන්ධ වන ප්‍රධාන සෛල බවත්, ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටෝම් විශ්ලේෂණයෙන් ලබාගත් අපගේ පෙර සොයාගැනීම් මත පදනම්ව අපි මානව LX-2 සෛල භාවිතා කිරීමට තෝරා ගත්තෙමු [15]. අක්මාව බහු සෛල වර්ග වලින් සමන්විත වන බැවින්, කැස්පේස් සක්‍රිය කිරීම සහ DNA ඛණ්ඩනය සමඟ ඒකාබද්ධ වූ හෙපටෝසයිට්-HSC-ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල සහ-සංස්කෘතික පද්ධතිය මෙන්ම ප්‍රෝටීන් මට්ටම ඇතුළු ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණය වැනි අනෙකුත් සෛල ආකෘති IPA හි කාර්යභාරය සහ අනෙකුත් අක්මා සෛල වර්ග සමඟ එහි අන්තර්ක්‍රියා අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා සලකා බැලිය යුතුය.