මෙම ලිපිය "රෝගකාරක සහ පළිබෝධකයන්ට රනිල කුලයට අයත් බෝග වල ප්‍රතිරෝධය වැඩි දියුණු කිරීම" යන පර්යේෂණ මාතෘකාවේ කොටසකි, සියලුම ලිපි 5 බලන්න.
දිලීර ශාක රෝගයේ රෝග කාරකය වන නෙරෝසිස් Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary විවිධ ධාරක ශාක ආසාදනය කිරීම සඳහා බහු-ස්ථර උපාය මාර්ගයක් භාවිතා කරයි. මෙම අධ්‍යයනයෙන් යෝජනා කරන්නේ Phaseolus vulgaris L. හි අණුක, භෞතික විද්‍යාත්මක සහ ජෛව රසායනික ප්‍රතිචාර වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා විකල්ප කළමනාකරණ උපාය මාර්ගයක් ලෙස අනෙකුත් අත්‍යවශ්‍ය ඇමයිනෝ අම්ල සංස්ලේෂණය උත්තේජනය කරන ප්‍රෝටීන් නොවන ඇමයිනෝ අම්ලයක් වන ඩයමයින් L-ornithine භාවිතා කිරීමයි. අභ්‍යන්තර අත්හදා බැලීම්වලින් පෙනී ගියේ L-ornithine මාත්‍රාව මත රඳා පවතින ආකාරයෙන් S. pyrenoidosa හි mycelial වර්ධනය සැලකිය යුතු ලෙස වළක්වන බවයි. එපමණක් නොව, හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ සුදු අච්චුවේ බරපතලකම සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළ හැකිය. තවද, L-ornithine ප්‍රතිකාර කළ ශාකවල වර්ධනය උත්තේජනය කළ අතර, L-ornithine හි පරීක්ෂා කරන ලද සාන්ද්‍රණය ප්‍රතිකාර කළ ශාක සඳහා ෆයිටොටොක්සික් නොවන බව පෙන්නුම් කරයි. ඊට අමතරව, L-ornithine එන්සයිම නොවන ප්‍රතිඔක්සිකාරක (සම්පූර්ණ ද්‍රාව්‍ය ෆීනෝලික් සහ ෆ්ලේවනොයිඩ්) සහ එන්සයිම ප්‍රතිඔක්සිකාරක (කැටලේස් (CAT), පෙරොක්සිඩේස් (POX), සහ පොලිෆීනෝල් ​​ඔක්සිඩේස් (PPO)) ප්‍රකාශනය වැඩි දියුණු කළ අතර ප්‍රතිඔක්සිකාරක-ආශ්‍රිත ජාන තුනක (PvCAT1, PvSOD, සහ PvGR) ප්‍රකාශනය වැඩි කළේය. තවද, සිලිකෝ විශ්ලේෂණයේදී S. sclerotiorum ජෙනෝමය තුළ උපකල්පිත ඔක්සලෝඇසිටේට් ඇසිටිල්හයිඩ්‍රොලේස් (SsOAH) ප්‍රෝටීනයක් පවතින බව අනාවරණය වූ අතර එය ක්‍රියාකාරී විශ්ලේෂණය, සංරක්ෂිත වසම් සහ ස්ථලකය අනුව Aspergillus fijiensis (AfOAH) සහ Penicillium sp. (PlOAH) හි ඔක්සලෝඇසිටේට් ඇසිටිල්හයිඩ්‍රොලේස් (SsOAH) ප්‍රෝටීන වලට බෙහෙවින් සමාන විය. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, අර්තාපල් ඩෙක්ස්ට්‍රෝස් සුප් හොද්ද (PDB) මාධ්‍යයට L-ornithine එකතු කිරීම S. sclerotiorum mycelia හි SsOAH ජානයේ ප්‍රකාශනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය. ඒ හා සමානව, ප්‍රතිකාර කළ ශාක වලින් එකතු කරන ලද දිලීර මයිසීලියා වල SsOAH ජානයේ ප්‍රකාශනය L-ornithine බාහිරව යෙදීමෙන් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය. අවසාන වශයෙන්, PDB මාධ්‍යයේ සහ ආසාදිත කොළ දෙකෙහිම ඔක්සලික් අම්ල ස්‍රාවය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය. නිගමනයක් ලෙස, ආසාදිත ශාකවල රෙඩොක්ස් තත්ත්වය පවත්වා ගැනීම මෙන්ම ආරක්ෂක ප්‍රතිචාරය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා L-ornithine ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. මෙම අධ්‍යයනයේ ප්‍රතිඵල සුදු අච්චුව පාලනය කිරීමට සහ බෝංචි නිෂ්පාදනයට සහ අනෙකුත් භෝග වලට එහි බලපෑම අවම කිරීමට නව්‍ය, පරිසර හිතකාමී ක්‍රම සංවර්ධනය කිරීමට උපකාරී විය හැකිය.
සුදු පුස්, නෙක්‍රොට්‍රොෆික් දිලීර Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary නිසා ඇති වන අතර, එය ගෝලීය බෝංචි (Phaseolus vulgaris L.) නිෂ්පාදනයට බරපතල තර්ජනයක් එල්ල කරන විනාශකාරී, අස්වැන්න අඩු කරන රෝගයකි (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum යනු පාලනය කිරීමට අපහසුම පසෙන් බෝවන දිලීර ශාක රෝග කාරක වලින් එකකි, ශාක විශේෂ 600 කට වඩා පුළුල් පරාසයක ධාරක පරාසයක් සහ නිශ්චිත නොවන ආකාරයකින් ධාරක පටක වේගයෙන් මැක්රේට් කිරීමේ හැකියාව ඇත (Liang and Rollins, 2018). අහිතකර තත්වයන් යටතේ, එය එහි ජීවන චක්‍රයේ තීරණාත්මක අවධියකට භාජනය වන අතර, පසෙහි 'sclerotia' ලෙස හඳුන්වන කළු, තද, බීජ වැනි ව්‍යුහයන් ලෙස හෝ ආසාදිත ශාකවල mycelium හෝ කඳේ කඳේ සුදු, සුදුමැලි වර්ධනයන් ලෙස දිගු කාලයක් නිද්‍රාශීලීව පවතී (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum හට ස්ක්ලෙරෝටියා සෑදීමට හැකියාව ඇති අතර, එමඟින් ආසාදිත ක්ෂේත්‍රවල දිගු කාලයක් ජීවත් වීමට සහ රෝග අතරතුර නොනැසී පැවතීමට ඉඩ සලසයි (Schwartz et al., 2005). Sclerotia පෝෂ්‍ය පදාර්ථ වලින් පොහොසත් වන අතර, පසෙහි දිගු කාලයක් පැවතිය හැකි අතර, පසුව ඇතිවන ආසාදන සඳහා ප්‍රාථමික එන්නත් ලෙස සේවය කරයි (Schwartz et al., 2005). හිතකර තත්වයන් යටතේ, ස්ක්ලෙරෝටියා ප්‍රරෝහණය වී වාතයෙන් බෝවන බීජාණු නිපදවන අතර එමඟින් මල්, කඳන් හෝ කරල් ඇතුළුව නමුත් ඒවාට පමණක් සීමා නොවී ශාකයේ සියලුම ඉහළ බිම් කොටස් වලට ආසාදනය විය හැකිය (Schwartz et al., 2005).
ස්ක්ලෙරෝටීනියා ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් එහි ධාරක ශාක ආසාදනය කිරීම සඳහා බහු-ස්ථර උපාය මාර්ගයක් භාවිතා කරයි, එයට ස්ක්ලෙරෝටියල් ප්‍රරෝහණයේ සිට රෝග ලක්ෂණ වර්ධනය දක්වා සම්බන්ධීකරණ සිදුවීම් මාලාවක් ඇතුළත් වේ. මුලදී, එස්. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් ඇපොතේෂියා ලෙස හඳුන්වන හතු වැනි ව්‍යුහයන්ගෙන් අත්හිටුවන ලද බීජාණු (ඇස්කොස්පෝර් ලෙස හැඳින්වේ) නිපදවයි, ඒවා වාතයෙන් බෝ වී ආසාදිත ශාක සුන්බුන් මත චලනය නොවන ස්ක්ලෙරෝටියා බවට වර්ධනය වේ (බෝල්ටන් සහ වෙනත් අය, 2006). ඉන්පසු දිලීර ශාක සෛල බිත්තියේ pH අගය පාලනය කිරීමට, එන්සයිම හායනය සහ පටක ආක්‍රමණය ප්‍රවර්ධනය කිරීමට සහ ධාරක ශාකයේ ඔක්සිකාරක පිපිරීම මර්දනය කිරීමට වෛරස් සාධකයක් වන ඔක්සලික් අම්ලය ස්‍රාවය කරයි (හෙගෙඩස් සහ රිමර්, 2005), සහ ධාරක ශාකයේ ඔක්සිකාරක පිපිරීම මර්දනය කරයි. මෙම ආම්ලිකකරණ ක්‍රියාවලිය ශාක සෛල බිත්තිය දුර්වල කරයි, දිලීර සෛල බිත්ති හායන එන්සයිම (CWDEs) සාමාන්‍ය හා කාර්යක්ෂම ක්‍රියාකාරිත්වය සඳහා හිතකර පරිසරයක් සපයයි, රෝග කාරකයට භෞතික බාධකය ජය ගැනීමට සහ ධාරක පටක වලට විනිවිද යාමට ඉඩ සලසයි (මාර්සියානෝ සහ වෙනත් අය, 1983). විනිවිද ගිය පසු, S. sclerotiorum, පොලිගලැක්ටුරෝනේස් සහ සෙලියුලේස් වැනි CWDE ගණනාවක් ස්‍රාවය කරයි, එය ආසාදිත පටක වල එහි ව්‍යාප්තියට පහසුකම් සපයන අතර පටක නෙරෝසිස් ඇති කරයි. තුවාල සහ හයිෆල් පැදුරු වල ප්‍රගතිය සුදු අච්චුවේ ලාක්ෂණික රෝග ලක්ෂණ වලට මග පාදයි (Hegedus සහ Rimmer, 2005). මේ අතර, ධාරක ශාක රටා හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිග්‍රාහක (PRRs) හරහා රෝගකාරක-ආශ්‍රිත අණුක රටා (PAMPs) හඳුනා ගනී, අවසානයේ ආරක්ෂක ප්‍රතිචාර සක්‍රීය කරන සංඥා සිදුවීම් මාලාවක් අවුලුවයි.
දශක ගණනාවක් තිස්සේ රෝග පාලනය කිරීමට උත්සාහ කළද, අනෙකුත් වාණිජ භෝගවල මෙන් බෝංචි වලද ප්‍රමාණවත් ප්‍රතිරෝධී ජර්ම්ප්ලාස්ම හිඟයක් පවතී, රෝග කාරකයේ ප්‍රතිරෝධය, පැවැත්ම සහ අනුවර්තනය වීමේ හැකියාව හේතුවෙන්. එබැවින් රෝග කළමනාකරණය අතිශයින් අභියෝගාත්මක වන අතර සංස්කෘතික පිළිවෙත්, ජීව විද්‍යාත්මක පාලනය සහ රසායනික දිලීර නාශකවල එකතුවක් ඇතුළත් ඒකාබද්ධ, බහුකාර්ය උපාය මාර්ගයක් අවශ්‍ය වේ (O'Sullivan et al., 2021). සුදු පුස් රසායනික පාලනය වඩාත් ඵලදායී වන්නේ දිලීර නාශක නිවැරදිව හා නියම වේලාවට යෙදූ විට රෝගය පැතිරීම ඵලදායී ලෙස පාලනය කිරීමට, ආසාදනයේ බරපතලකම අඩු කිරීමට සහ අස්වැන්න පාඩු අවම කිරීමට හැකි බැවිනි. කෙසේ වෙතත්, අධික ලෙස භාවිතා කිරීම සහ දිලීර නාශක මත අධික ලෙස රඳා පැවතීම S. sclerotiorum හි ප්‍රතිරෝධී වික්‍රියා මතුවීමට හේතු විය හැකි අතර ඉලක්කගත නොවන ජීවීන්ට, පසෙහි සෞඛ්‍යයට සහ ජල ගුණාත්මක භාවයට අහිතකර ලෙස බලපායි (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). එබැවින්, පරිසර හිතකාමී විකල්ප සොයා ගැනීම ප්‍රමුඛතාවයක් බවට පත්ව ඇත.
පුට්‍රෙස්සීන්, ස්පර්මිඩීන්, ස්පර්මයින් සහ කැඩවෙරීන් වැනි පොලිඇමයින් (PAs), පසෙන් බෝවන ශාක රෝග කාරක වලට එරෙහිව පොරොන්දු වූ විකල්ප ලෙස සේවය කළ හැකි අතර, එමඟින් අන්තරායකර රසායනික දිලීර නාශක භාවිතය සම්පූර්ණයෙන්ම හෝ අර්ධ වශයෙන් අඩු කරයි (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). ඉහළ ශාකවල, PAs සෛල බෙදීම, අවකලනය සහ අජීවී සහ ජෛව ආතතීන්ට ප්‍රතිචාර දැක්වීම ඇතුළු බොහෝ භෞතික විද්‍යාත්මක ක්‍රියාවලීන්හි නිරත වේ (Killiny and Nehela, 2020). ඒවාට ප්‍රතිඔක්සිකාරක ලෙස ක්‍රියා කළ හැකිය, ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂ (ROS) ඉවත් කිරීමට උපකාරී වේ, රෙඩොක්ස් හෝමියස්ටැසිස් පවත්වා ගත හැකිය (නෙහෙලා සහ කිලිනි, 2023), ආරක්ෂක ආශ්‍රිත ජාන ප්‍රේරණය කරයි (රොමෙරෝ සහ වෙනත් අය, 2018), විවිධ පරිවෘත්තීය මාර්ග නියාමනය කරයි (නෙහෙලා සහ කිලිනි, 2023), අන්තරාසර්ග ෆයිටෝහෝමෝන මොඩියුලේට් කරයි (නෙහෙලා සහ කිලිනි, 2019), පද්ධතිමය අත්පත් කරගත් ප්‍රතිරෝධය (SAR) ස්ථාපිත කරයි, සහ ශාක-රෝගකාරක අන්තර්ක්‍රියා නියාමනය කරයි (නෙහෙලා සහ කිලිනි, 2020; අසිජා සහ වෙනත් අය, 2022; චෙසර්වොනික්, 2022). ශාක ආරක්ෂාව සඳහා PA වල නිශ්චිත යාන්ත්‍රණ සහ භූමිකාවන් ශාක විශේෂ, රෝග කාරක සහ පාරිසරික තත්ත්වයන් අනුව වෙනස් වන බව සඳහන් කිරීම වටී. ශාකවල බහුලවම ඇති PA අත්‍යවශ්‍ය පොලිඇමයින් L-ornithine වලින් ජෛව සංස්ලේෂණය කර ඇත (කිලිනි සහ නෙහෙලා, 2020).
L-ornithine ශාක වර්ධනය හා සංවර්ධනය සඳහා බහුවිධ කාර්යභාරයන් ඉටු කරයි. උදාහරණයක් ලෙස, පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ සහල් (Oryza sativa) වල, ornithine නයිට්‍රජන් ප්‍රතිචක්‍රීකරණය (Liu et al., 2018), සහල් අස්වැන්න, ගුණාත්මකභාවය සහ සුවඳ (Lu et al., 2020) සහ ජල පීඩන ප්‍රතිචාරය (Yang et al., 2000) සමඟ සම්බන්ධ විය හැකි බවයි. තවද, L-ornithine බාහිරව යෙදීම සීනි බීට් (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) වල නියඟ ඉවසීම සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කළ අතර ළූණු (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu සහ Çavuşoǧlu, 2021) සහ කජු (Anacardium occidentale) ශාකවල ලුණු ආතතිය සමනය කළේය (da Rocha et al., 2012). අජීවී ආතති ආරක්ෂාව සඳහා L-ornithine හි විභව කාර්යභාරය ප්‍රතිකාර කළ ශාකවල ප්‍රෝලීන් සමුච්චය කිරීමේදී එහි සහභාගීත්වය නිසා විය හැකිය. උදාහරණයක් ලෙස, ඕර්නයිතින් ඩෙල්ටා ඇමයිනොට්‍රාන්ස්ෆෙරේස් (ඩෙල්ටා-OAT) සහ ප්‍රෝලයින් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් (ProDH1 සහ ProDH2) ජාන වැනි ප්‍රෝලයින් පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට අදාළ ජාන, නිකොටියානා බෙන්තමියානා සහ අරාබිඩොප්සිස් තාලියානා සත්කාරක නොවන Pseudomonas සිරින්ජේ වික්‍රියා වලට එරෙහිව ආරක්ෂා කිරීමට සම්බන්ධ වන බව මීට පෙර වාර්තා වී ඇත (සෙන්තිල්-කුමාර් සහ මයිසූර්, 2012). අනෙක් අතට, රෝග කාරක වර්ධනය සඳහා දිලීර ඕර්නයිතින් ඩෙකාබොක්සිලේස් (ODC) අවශ්‍ය වේ (සිං සහ වෙනත් අය, 2020). ධාරක-ප්‍රේරිත ජාන නිශ්ශබ්ද කිරීම (HIGS) හරහා ෆුසාරියම් ඔක්සිස්පෝරම් f. sp. ලයිකොපර්සිසි හි ODC ඉලක්ක කිරීම ෆියුසාරියම් මැලවීමට තක්කාලි ශාකවල ප්‍රතිරෝධය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කළේය (සිං සහ වෙනත් අය, 2020). කෙසේ වෙතත්, ෆයිටොපාතොජන් වැනි ජෛව ආතතීන්ට එරෙහිව බාහිර ඕර්නයිතින් යෙදීමේ විභව භූමිකාව හොඳින් අධ්‍යයනය කර නොමැත. වඩාත් වැදගත් දෙය නම්, රෝග ප්‍රතිරෝධයට ඕර්නයිටින් වල බලපෑම සහ ඒ ආශ්‍රිත ජෛව රසායනික හා භෞතික විද්‍යාත්මක සංසිද්ධි තවමත් බොහෝ දුරට ගවේෂණය කර නොමැති වීමයි.
රනිල කුලයට අයත් බෝග වල S. sclerotiorum ආසාදනයේ සංකීර්ණතාවය අවබෝධ කර ගැනීම ඵලදායී පාලන උපාය මාර්ග සංවර්ධනය කිරීම සඳහා වැදගත් වේ. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, Sclerotinia sclerotiorum ආසාදනයට රනිල කුලයට අයත් ශාකවල ආරක්ෂක යාන්ත්‍රණ සහ ප්‍රතිරෝධය වැඩි දියුණු කිරීමේදී ප්‍රධාන සාධකයක් ලෙස ඩයමයින් L-ornithine හි විභව භූමිකාව හඳුනා ගැනීම අපගේ අරමුණ විය. ආසාදිත ශාකවල ආරක්ෂක ප්‍රතිචාර වැඩි දියුණු කිරීමට අමතරව, රෙඩොක්ස් තත්ත්වය පවත්වා ගැනීම සඳහා L-ornithine ද ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව අපි උපකල්පනය කරමු. L-ornithine හි විභව බලපෑම් එන්සයිම සහ එන්සයිම නොවන ප්‍රතිඔක්සිකාරක ආරක්ෂක යාන්ත්‍රණ නියාමනය කිරීම සහ දිලීර රෝගකාරක/වෛරස් සාධක සහ ඒ ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන සමඟ ඇඟිලි ගැසීම් සමඟ සම්බන්ධ වන බව අපි යෝජනා කරමු. L-ornithine හි මෙම ද්විත්ව ක්‍රියාකාරිත්වය සුදු අච්චුවේ බලපෑම අවම කිරීම සහ මෙම ප්‍රබල දිලීර රෝග කාරකයට පොදු රනිල කුලයට අයත් බෝගවල ප්‍රතිරෝධය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා තිරසාර උපාය මාර්ගයක් සඳහා පොරොන්දු වූ අපේක්ෂකයෙකු බවට පත් කරයි. වර්තමාන අධ්‍යයනයේ ප්‍රතිඵල සුදු අච්චුව පාලනය කිරීමට සහ රනිල කුලයට අයත් බෝග නිෂ්පාදනයට එහි බලපෑම අවම කිරීම සඳහා නව්‍ය, පරිසර හිතකාමී ක්‍රම සංවර්ධනය කිරීමට උපකාරී විය හැකිය.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී, පොදු බෝංචි වල සංවේදී වාණිජ ප්‍රභේදයක් වන Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) පර්යේෂණාත්මක ද්‍රව්‍යයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. ඊජිප්තුවේ කෘෂිකාර්මික පර්යේෂණ මධ්‍යස්ථානය (ARC), ක්ෂේත්‍ර බෝග පර්යේෂණ ආයතනය (FCRI), රනිල කුලයට අයත් පර්යේෂණ දෙපාර්තමේන්තුව විසින් සෞඛ්‍ය සම්පන්න බීජ කාරුණිකව සපයන ලදී. හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ (25 ± 2 °C, සාපේක්ෂ ආර්ද්‍රතාවය 75 ± 1%, පැය 8 ආලෝකය / පැය 16 අඳුරු) S. sclerotiorum-ආසාදිත පසෙන් පුරවා ඇති ප්ලාස්ටික් භාජනවල (අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භය 35 සෙ.මී., ගැඹුර 50 සෙ.මී.) බීජ පහක් වපුරා ඇත. වැපිරීමෙන් පසු දින 7-10 (DPS), බීජ පැල තුනී කරන ලද අතර ඒකාකාර වර්ධනයක් සහිත බීජ පැල දෙකක් සහ සෑම භාජනයකම සම්පූර්ණයෙන්ම ප්‍රසාරණය වූ කොළ තුනක් පමණක් ඉතිරි වේ. සියලුම බඳුන් කළ ශාක සති දෙකකට වරක් වතුර දමන ලද අතර ලබා දී ඇති ප්‍රභේදය සඳහා නිර්දේශිත අනුපාතයට මාසිකව පොහොර දමන ලදී.
L-ornithinediamine ((+)-(S)-2,5-diaminopentanoic අම්ලය ලෙසද හැඳින්වේ; Sigma-Aldrich, Darmstadt, ජර්මනිය) හි 500 mg/L සාන්ද්‍රණයක් සකස් කිරීම සඳහා, 50 mg මුලින්ම විෂබීජහරණය කළ ආසවනය කළ ජලය මිලි ලීටර් 100 ක දියකර ඇත. තොග ද්‍රාවණය පසුව තනුක කර පසුව අත්හදා බැලීම් වලදී භාවිතා කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, L-ornithine සාන්ද්‍රණ ශ්‍රේණි හයක් (12.5, 25, 50, 75, 100, සහ 125 mg/L) in vitro පරීක්ෂාවට ලක් කරන ලදී. ඊට අමතරව, විෂබීජහරණය කළ ආසවනය කළ ජලය සෘණ පාලනයක් (Mock) ලෙස භාවිතා කරන ලද අතර වාණිජ දිලීර නාශකයක් වන "Rizolex-T" 50% තෙත් කළ හැකි කුඩු (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat පළිබෝධනාශක සහ රසායනික ද්‍රව්‍ය සමාගම, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, ඊජිප්තුව) ධනාත්මක පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. වාණිජ දිලීර නාශක "Rizolex-T" සාන්ද්‍රණ පහකින් (2, 4, 6, 8 සහ 10 mg/L) විට්‍රෝ පරීක්ෂාවට ලක් කරන ලදී.
සුදු පුස් රෝග ලක්ෂණ පෙන්නුම් කරන සාමාන්‍ය බෝංචි කඳන් සහ කරල් වල සාම්පල වාණිජ ගොවිපලවලින් එකතු කරන ලදී (ආසාදන අනුපාතය: 10-30%). ආසාදිත ශාක ද්‍රව්‍ය බොහොමයක් විශේෂ/ප්‍රභේදය (Giza 3 වලට ගොදුරු විය හැකි වාණිජ ප්‍රභේදය) අනුව හඳුනාගෙන ඇතත්, අනෙකුත් ඒවා, විශේෂයෙන් දේශීය වෙළඳපොලෙන් ලබාගත් ඒවා, නොදන්නා විශේෂ විය. එකතු කරන ලද ආසාදිත ද්‍රව්‍ය පළමුව මතුපිට 0.5% සෝඩියම් හයිපොක්ලෝරයිට් ද්‍රාවණයකින් මිනිත්තු 3 ක් විෂබීජහරණය කර, පසුව විෂබීජහරණය කළ ආසවනය කළ ජලයෙන් කිහිප වතාවක් සෝදා, අතිරික්ත ජලය ඉවත් කිරීම සඳහා විෂබීජහරණය කළ පෙරහන් කඩදාසිවලින් වියළා ගන්නා ලදී. ආසාදිත අවයව පසුව මැද පටක වලින් කුඩා කැබලිවලට කපා (සෞඛ්‍ය සම්පන්න සහ ආසාදිත පටක අතර), අර්තාපල් ඩෙක්ස්ට්‍රෝස් ඒගාර් (PDA) මාධ්‍යය මත වගා කර, ස්ක්ලෙරෝටියා සෑදීම උත්තේජනය කිරීම සඳහා දින 5 ක් සඳහා පැය 12 ක ආලෝක/පැය 12 ක අඳුරු චක්‍රයක් සමඟ 25 ± 2 °C උෂ්ණත්වයකදී පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. මිශ්‍ර හෝ දූෂිත සංස්කෘතීන්ගෙන් දිලීර හුදකලා කිරීම් පිරිසිදු කිරීම සඳහා මයිසීලියල් ටිප් ක්‍රමය ද භාවිතා කරන ලදී. පිරිසිදු කරන ලද දිලීර හුදකලාව මුලින්ම හඳුනාගනු ලැබුවේ එහි සංස්කෘතික රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ මත වන අතර පසුව අන්වීක්ෂීය ලක්ෂණ මත පදනම්ව S. sclerotiorum බව තහවුරු කරන ලදී. අවසාන වශයෙන්, සියලුම පිරිසිදු කරන ලද හුදකලා කිරීම්, කෝච්ගේ උපකල්පන සපුරාලීම සඳහා සංවේදී පොදු බෝංචි වගාවක් වන Giza 3 මත ව්යාධිජනක බව සඳහා පරීක්ෂා කරන ලදී.
ඊට අමතරව, White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 විසින් විස්තර කරන ලද අභ්‍යන්තර පිටපත් කරන ලද ස්පේසර් (ITS) අනුක්‍රමය මත පදනම්ව වඩාත් ආක්‍රමණශීලී S. sclerotiorum හුදකලාව (හුදකලා #3) තවදුරටත් තහවුරු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, හුදකලා අර්තාපල් ඩෙක්ස්ට්‍රෝස් සුප් හොද්ද (PDB) තුළ වගා කර දින 5-7 ක් සඳහා 25 ± 2 °C උෂ්ණත්වයකදී පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. ඉන්පසු දිලීර mycelium එකතු කර, චීස්ක්ලෝත් හරහා පෙරා, දෙවරක් විෂබීජහරණය කළ ජලයෙන් සෝදා, විෂබීජහරණය කළ පෙරහන් කඩදාසිවලින් වියළන ලදී. Quick-DNA™ දිලීර/බැක්ටීරියා Miniprep කට්ටලය භාවිතයෙන් ජානමය DNA හුදකලා කරන ලදී (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ඉන්පසු ITS rDNA කලාපය නිශ්චිත ප්‍රයිමර් යුගලය ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; අපේක්ෂිත ප්‍රමාණය: 540 bp) භාවිතයෙන් විස්තාරණය කරන ලදී (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). පිරිසිදු කරන ලද PCR නිෂ්පාදන අනුක්‍රමණය සඳහා ඉදිරිපත් කරන ලදී (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA අනුපිළිවෙලවල් Sanger අනුක්‍රමණ ක්‍රමය භාවිතයෙන් ද්විපාර්ශ්විකව අනුක්‍රමණය කරන ලදී. එකලස් කරන ලද විමසුම් අනුපිළිවෙලවල් BLASTn මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් GenBank සහ ජෛව තාක්‍ෂණ තොරතුරු සඳහා ජාතික මධ්‍යස්ථානයේ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) නවතම දත්ත සමඟ සංසන්දනය කරන ලදී. විමසුම් අනුපිළිවෙල අණුක පරිණාමීය ජාන විද්‍යා විශ්ලේෂණ පැකේජයේ (MEGA-11; අනුවාදය 11) ClustalW භාවිතයෙන් NCBI GenBank (පරිපූරක වගුව S1) හි නවතම දත්ත වලින් ලබාගත් අනෙකුත් S. sclerotiorum වික්‍රියා/හුස්ම 20 ක් සමඟ සංසන්දනය කරන ලදී (Kumar et al., 2024). පරිණාමීය විශ්ලේෂණය උපරිම සම්භාවිතා ක්‍රමය සහ සාමාන්‍ය කාල-ප්‍රතිවර්ත කළ හැකි නියුක්ලියෝටයිඩ ආදේශන ආකෘතිය (Nei and Kumar, 2000) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. ඉහළම ලඝු-සම්භාවිතා හැකියාව ඇති ගස පෙන්වා ඇත. හියුරිස්ටික් සෙවීම සඳහා ආරම්භක ගස තෝරා ගනු ලබන්නේ අසල්වැසි-සම්බන්ධ වීමේ (NJ) ගස (Kumar et al., 2024) සහ උපරිම parsimony (MP) ගස අතර ඉහළ ලඝු-සම්භාව්‍යතාවයක් ඇති ගස තෝරා ගැනීමෙනි. NJ ගස සාමාන්‍ය කාල-ප්‍රතිවර්ත කළ හැකි ආකෘතිය (Nei and Kumar, 2000) භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද යුගල වශයෙන් දුර අනුකෘතියක් භාවිතයෙන් ඉදිකරන ලදී.
L-ornithine සහ "Rizolex-T" බැක්ටීරියා නාශකයේ ප්‍රතිබැක්ටීරීය ක්‍රියාකාරිත්වය agar diffusion ක්‍රමය මගින් in vitro තුළ තීරණය කරන ලදී. ක්‍රමය: L-ornithine (500 mg/L) තොග ද්‍රාවණයෙන් සුදුසු ප්‍රමාණයක් ගෙන PDA පෝෂක මාධ්‍යයේ මිලි ලීටර් 10 ක් සමඟ හොඳින් මිශ්‍ර කර පිළිවෙලින් 12.5, 25, 50, 75, 100 සහ 125 mg/L අවසාන සාන්ද්‍රණයන් සහිත ද්‍රාවණ සකස් කරන්න. පාලනයක් ලෙස "Rizolex-T" දිලීර නාශකයේ සාන්ද්‍රණ පහක් (2, 4, 6, 8 සහ 10 mg/L) සහ විෂබීජහරණය කළ ආසවනය කළ ජලය භාවිතා කරන ලදී. මාධ්‍යය ඝන වූ පසු, විෂ්කම්භය 4 mm වන Sclerotinia sclerotiorum සංස්කෘතියේ නැවුම්ව සකස් කරන ලද mycelial ප්ලග් එකක් පෙට්‍රි පිඟානේ මැදට මාරු කර 25±2°C දී mycelium මුළු පාලන පෙට්‍රි පිඟානම ආවරණය වන තෙක් වගා කරන ලද අතර, පසුව දිලීර වර්ධනය වාර්තා කරන ලදී. සමීකරණය 1 භාවිතා කරමින් S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් වල රේඩියල් වර්ධනයේ ප්‍රතිශත නිෂේධනය ගණනය කරන්න:
අත්හදා බැලීම දෙවරක් පුනරාවර්තනය කරන ලද අතර, එක් එක් පාලන/පරීක්ෂණාත්මක කණ්ඩායම සඳහා ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ හයක් සහ එක් එක් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුව සඳහා භාජන පහක් (බඳුනකට ශාක දෙකක්) බැගින් සිදු කරන ලදී. පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵලවල නිරවද්‍යතාවය, විශ්වසනීයත්වය සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය සහතික කිරීම සඳහා සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක්ම දෙවරක් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (තාක්ෂණික අනුරූ දෙකක්). ඊට අමතරව, අර්ධ-උපරිම නිෂේධනීය සාන්ද්‍රණය (IC50) සහ IC99 ගණනය කිරීම සඳහා ප්‍රොබිට් ප්‍රතිගාමී විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී (ප්‍රෙන්ටිස්, 1976).
හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ L-ornithine වල විභවය තක්සේරු කිරීම සඳහා, අඛණ්ඩව භාජන අත්හදා බැලීම් දෙකක් සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, භාජන විෂබීජහරණය කළ මැටි-වැලි පසෙන් (3:1) පුරවා, S. sclerotiorum හි නැවුම්ව සකස් කරන ලද සංස්කෘතියකින් එන්නත් කරන ලදී. පළමුව, S. sclerotiorum හි වඩාත්ම ආක්‍රමණශීලී හුදකලාව (හුදකලා #3) වගා කරන ලද්දේ එක් ස්ක්ලෙරෝටියම් එකක් අඩකින් කපා, PDA එකක් මත මුහුණට පහළට තබා, මයිසීලියල් වර්ධනය උත්තේජනය කිරීම සඳහා දින 4 ක් 25°C උෂ්ණත්වයේ (පැය 24) නිරන්තර අන්ධකාරයේ (පැය 24) ඉන්කියුබේට් කිරීමෙනි. ඉන්පසු ප්‍රමුඛ දාරයෙන් 5 mm විෂ්කම්භයකින් යුත් ඒගාර් ප්ලග් හතරක් ගෙන තිරිඟු සහ සහල් නිවුඩ්ඩ (1:1, v/v) විෂබීජහරණය කළ මිශ්‍රණයකින් ග්‍රෑම් 100 ක් එන්නත් කරන ලද අතර, සියලුම ෆ්ලාස්ක් පැය 12 ක ආලෝක/පැය 12 ක අඳුරු චක්‍රයක් යටතේ දින 5 ක් 25 ± 2 °C උෂ්ණත්වයකදී ස්ක්ලෙරෝටියා සෑදීම උත්තේජනය කිරීම සඳහා ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. පස එකතු කිරීමට පෙර සමජාතීයතාවය සහතික කිරීම සඳහා සියලුම ෆ්ලාස්ක් වල අන්තර්ගතය හොඳින් මිශ්‍ර කරන ලදී. ඉන්පසු, රෝග කාරකවල නිරන්තර සාන්ද්‍රණය සහතික කිරීම සඳහා, ජනපදකරණ නිවුඩ්ඩ මිශ්‍රණයෙන් ග්‍රෑම් 100 ක් සෑම භාජනයකටම එකතු කරන ලදී. දිලීර වර්ධනය සක්‍රීය කිරීම සඳහා එන්නත් කරන ලද භාජනවලට වතුර දමා දින 7 ක් හරිතාගාර තත්වයන් තුළ තබන ලදී.
ඉන්පසු Giza 3 ප්‍රභේදයේ බීජ පහක් එක් එක් භාජනයක වපුරන ලදී. L-ornithine සහ දිලීර නාශක Rizolex-T සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද භාජන සඳහා, විෂබීජහරණය කරන ලද බීජ පළමුව පිළිවෙලින් 250 mg/L සහ 50 mg/L පමණ අවසාන IC99 සාන්ද්‍රණයක් සහිත සංයෝග දෙකෙහි ජලීය ද්‍රාවණයක පැය දෙකක් පොඟවා, පසුව වැපිරීමට පෙර පැයක් වාතයේ වියළන ලදී. අනෙක් අතට, බීජ සෘණ පාලනයක් ලෙස විෂබීජහරණය කළ ආසවනය කළ ජලයේ පොඟවා ඇත. පළමු වතුර දැමීමට දින 10 කට පසු, බීජ පැල තුනී කරන ලද අතර, එක් එක් භාජනයේ පිළිවෙලට බීජ පැල දෙකක් පමණක් ඉතිරි විය. ඊට අමතරව, S. sclerotiorum ආසාදනය සහතික කිරීම සඳහා, එකම සංවර්ධන අවධියේ (දින 10) බෝංචි ශාක කඳන් විෂබීජහරණය කළ හිස්කබලක් භාවිතයෙන් විවිධ ස්ථාන දෙකක කපා, ජනපදකරණ නිවුඩ්ඩ මිශ්‍රණයෙන් ආසන්න වශයෙන් ග්‍රෑම් 0.5 ක් එක් එක් තුවාලයට දමන ලද අතර, පසුව එන්නත් කරන ලද සියලුම ශාකවල ආසාදනය හා රෝග වර්ධනය උත්තේජනය කිරීම සඳහා ඉහළ ආර්ද්‍රතාවයක් ඇති කරන ලදී. පාලන ශාක ද ඒ හා සමානව තුවාල ලැබූ අතර, සමාන ප්‍රමාණයක් (0.5 g) වඳ, ජනපදකරණය නොකළ නිවුඩ්ඩ මිශ්‍රණයක් තුවාලයට දමා, රෝග වර්ධනය සඳහා පරිසරය අනුකරණය කිරීමට සහ ප්‍රතිකාර කණ්ඩායම් අතර අනුකූලතාව සහතික කිරීමට ඉහළ ආර්ද්‍රතාවය යටතේ පවත්වා ගන්නා ලදී.
ප්‍රතිකාර ක්‍රමය: බෝංචි බීජ පැල L-ornithine (250 mg/l) ජලීය ද්‍රාවණයකින් මිලි ලීටර් 500 ක් හෝ Rizolex-T (50 mg/l) දිලීර නාශකයක් පසට ජලය සැපයීමෙන් වතුර දමන ලදී, පසුව ප්‍රතිකාරය දින 10 ක පරතරයකින් තුන් වරක් නැවත නැවතත් කරන ලදී. ප්ලේසෙබෝ ප්‍රතිකාර කළ පාලන විෂබීජහරණය කළ ආසවනය කළ ජලය මිලි ලීටර් 500 කින් ජලය සපයන ලදී. සියලුම ප්‍රතිකාර හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ සිදු කරන ලදී (25 ± 2°C, 75 ± 1% සාපේක්ෂ ආර්ද්‍රතාවය සහ පැය 8 ආලෝකය/අඳුරු පැය 16 ක ප්‍රභාකාලයක්). සියලුම භාජන දෙසතියකට වරක් වතුර දැමූ අතර සමතුලිත NPK පොහොර (20-20-20, 3.6% සල්ෆර් සහ TE ක්ෂුද්‍ර මූලද්‍රව්‍ය සමඟ; සයින් බීජ, ඊජිප්තුව) සමඟ මාසිකව 3-4 g/l සාන්ද්‍රණයකින් පත්‍ර ඉසීමෙන් නිශ්චිත ප්‍රභේදය සඳහා නිර්දේශ සහ නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව සකස් කරන ලදී. වෙනත් ආකාරයකින් සඳහන් නොකළහොත්, සම්පූර්ණයෙන්ම ප්‍රසාරණය වූ පරිණත කොළ (ඉහළ සිට 2 වන සහ 3 වන කොළ) එක් එක් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවෙන් පැය 72 ක පශ්චාත් ප්‍රතිකාර (hpt) හිදී එකතු කර, සමජාතීය කර, සංචිත කර, ඔක්සිකාරක ආතති දර්ශක ස්ථානීය හිස්ටොරෙමිකල් ස්ථානගත කිරීම, ලිපිඩ පෙරොක්සිකරණය, එන්සයිම සහ එන්සයිම නොවන ප්‍රතිඔක්සිකාරක සහ ජාන ප්‍රකාශනය ඇතුළුව, නමුත් ඒවාට සීමා නොවී වැඩිදුර විශ්ලේෂණයන් සඳහා -80 °C හි ගබඩා කරන ලදී.
ටෙරාන් සහ තවත් අය (2006) විසින් වෙනස් කරන ලද පෙට්සෝල්ඩ්ට් සහ ඩික්සන් පරිමාණය (1996) මත පදනම්ව එන්නත් කිරීමෙන් පසු දින 21 කට පසු (dpi) සුදු පුස් ආසාදන තීව්‍රතාවය සතිපතා තක්සේරු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, එන්නත් කිරීමේ ස්ථානයේ සිට අන්තරාල සහ නෝඩ් දිගේ තුවාල වල ප්‍රගතිය අනුගමනය කිරීම සඳහා බෝංචි ශාකවල කඳන් සහ අතු පරීක්ෂා කරන ලදී. එන්නත් කිරීමේ ස්ථානයේ සිට කඳ හෝ අත්ත දිගේ දුරම ස්ථානයට තුවාලයේ දුර මනිනු ලැබූ අතර තුවාලයේ පිහිටීම මත පදනම්ව 1–9 ලකුණු පවරන ලදී, එහිදී (1) එන්නත් කිරීමේ ස්ථානය අසල දෘශ්‍යමාන ආසාදනයක් නොමැති බව පෙන්නුම් කළ අතර (2–9) තුවාලයේ ප්‍රමාණය හා නෝඩ්/අන්තර් නෝඩ් දිගේ ප්‍රගතිය ක්‍රමයෙන් වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කළේය (අතිරේක වගුව S2). සුදු පුස් ආසාදන තීව්‍රතාවය පසුව සූත්‍රය 2 භාවිතා කරමින් ප්‍රතිශතයට පරිවර්තනය කරන ලදී:
ඊට අමතරව, රෝග ප්‍රගති වක්‍රය (AUDPC) යටතේ ඇති ප්‍රදේශය ගණනය කරන ලද්දේ සූත්‍රය (Shaner and Finney, 1977) භාවිතා කරමිනි, එය මෑතකදී 3 සමීකරණය භාවිතා කරමින් පොදු බෝංචි වල සුදු කුණුවීම සඳහා අනුවර්තනය කරන ලදී (Chauhan et al., 2020):
Yi = ti වේලාවේදී රෝගයේ බරපතලකම, Yi+1 = ඊළඟ අවස්ථාවේදී ti+1 වේලාවේදී රෝගයේ බරපතලකම, ti = පළමු මිනුමේ කාලය (දින වලින්), ti+1 = ඊළඟ මිනුමේ කාලය (දින වලින්), n = මුළු කාල ලක්ෂ්‍ය හෝ නිරීක්ෂණ ලක්ෂ්‍ය ගණන. සියලුම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූවල සතිපතා දින 21 ක් පුරා ශාක උස (සෙ.මී.), ශාකයකට අතු ගණන සහ ශාකයකට කොළ ගණන ඇතුළුව බෝංචි ශාක වර්ධන පරාමිතීන් වාර්තා කරන ලදී.
එක් එක් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවෙහි, ප්‍රතිකාරයෙන් පසු 45 වන දින (අවසාන ප්‍රතිකාරයෙන් දින 15 කට පසු) පත්‍ර සාම්පල (ඉහළ සිට දෙවන සහ තුන්වන සම්පූර්ණයෙන්ම වර්ධනය වූ කොළ) එකතු කරන ලදී. සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක්ම භාජන පහකින් (බඳුනකට ශාක දෙකක්) සමන්විත විය. අඳුරේ 4 °C දී 80% ඇසිටෝන් භාවිතා කරමින් ප්‍රභාසංස්ලේෂක වර්ණක (ක්ලෝරෝෆිල් a, ක්ලෝරෝෆිල් b සහ කැරොටිනොයිඩ්) නිස්සාරණය කිරීම සඳහා තලා දැමූ පටක වලින් මිලිග්‍රෑම් 500 ක් පමණ භාවිතා කරන ලදී. පැය 24 කට පසු, සාම්පල කේන්ද්‍රාපසාරී කර, විවිධ තරංග ආයාම තුනකින් (A470, A646 සහ A663 nm) අවශෝෂණය මැනීමෙන් (Lichtenthaler, 1987) ක්‍රමයට අනුව UV-160A වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (Shimadzu Corporation, Japan) භාවිතා කරමින් වර්ණමිතිකව ක්ලෝරෝෆිල් a, ක්ලෝරෝෆිල් b සහ කැරොටිනොයිඩ් අන්තර්ගතය තීරණය කිරීම සඳහා සුපිරි ද්‍රව්‍ය එකතු කරන ලදී. අවසාන වශයෙන්, ලිච්ටෙන්තලර් (1987) විසින් විස්තර කරන ලද පහත සූත්‍ර 4–6 භාවිතා කරමින් ප්‍රභාසංස්ලේෂක වර්ණකවල අන්තර්ගතය ගණනය කරන ලදී.
පැය 72 ක ප්‍රතිකාරයකින් පසු (hpt), හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් (H2O2) සහ සුපර් ඔක්සයිඩ් ඇනායන (O2•−) ස්ථානීය හිස්ටොරෙමිකල් ප්‍රාදේශීයකරණය සඳහා එක් එක් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවකින් කොළ (ඉහළින් දෙවන සහ තෙවන සම්පූර්ණයෙන්ම වර්ධනය වූ කොළ) එකතු කරන ලදී. සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක්ම භාජන පහකින් (බඳුනකට ශාක දෙකක්) සමන්විත විය. ක්‍රමයේ නිරවද්‍යතාවය, විශ්වසනීයත්වය සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය සහතික කිරීම සඳහා සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක්ම අනුපිටපත් (තාක්ෂණික අනුපිටපත් දෙකක්) ලෙස විශ්ලේෂණය කරන ලදී. H2O2 සහ O2•− පිළිවෙලින් 0.1% 3,3′-ඩයමිනොබෙන්සයිඩින් (DAB; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්, ඩාර්ම්ස්ටැඩ්, ජර්මනිය) හෝ නයිට්‍රොබ්ලූ ටෙට්‍රාසෝලියම් (NBT; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්, ඩාර්ම්ස්ටැඩ්, ජර්මනිය) භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලදී, සුළු වෙනස් කිරීම් සහිතව රොමේරෝ-පුවර්ටාස් සහ වෙනත් අය (2004) සහ ඇඩම් සහ වෙනත් අය (1989) විසින් විස්තර කරන ලද ක්‍රම අනුගමනය කරමින්. H2O2 ස්ථානීයව හිස්ටොරෙමිකල් ස්ථානගත කිරීම සඳහා, පත්‍රිකා 10 mM ට්‍රිස් බෆරයේ (pH 7.8) 0.1% DAB සමඟ රික්තක ආක්‍රමණය කරන ලද අතර පසුව කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 60 ක් ආලෝකයේ දී ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. පත්‍රිකා 4:1 (v/v) එතනෝල්:ක්ලෝරෝෆෝම් (අල්-ගොම්හෝරියා ඖෂධ සහ වෛද්‍ය සැපයුම්, කයිරෝ, ඊජිප්තුව) හි 0.15% (v/v) TCA හි විරංජනය කරන ලද අතර පසුව ඒවා අඳුරු වන තෙක් ආලෝකයට නිරාවරණය කරන ලදී. ඒ හා සමානව, O2•− ස්ථානීයව හිස්ටොරෙමිකල් ස්ථානගත කිරීම සඳහා කපාට 0.1 w/v % HBT අඩංගු 10 mM පොටෑසියම් පොස්පේට් බෆරය (pH 7.8) සමඟ රික්තක ආක්‍රමණය කරන ලදී. පත්‍රිකා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ආලෝකයේ විනාඩි 20 ක් පුර්ව ගන්වන ලද අතර, පසුව ඉහත පරිදි විරංජනය කරන ලද අතර, පසුව තද නිල්/වයලට් ලප දිස්වන තෙක් ආලෝකමත් කරන ලදී. ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබෙන දුඹුරු (H2O2 දර්ශකයක් ලෙස) හෝ නිල්-වයලට් (O2•− දර්ශකයක් ලෙස) වර්ණයෙහි තීව්‍රතාවය ImageJ (http://fiji.sc; ප්‍රවේශ වූයේ 2024 මාර්තු 7 වන දින) රූප සැකසුම් පැකේජයේ ෆීජි අනුවාදය භාවිතයෙන් තක්සේරු කරන ලදී.
මැලොන්ඩියල්ඩිහයිඩ් (MDA; ලිපිඩ පෙරොක්සිකරණයේ සලකුණක් ලෙස) ඩු සහ බ්‍රැම්ලේජ් (1992) ක්‍රමයට අනුව සුළු වෙනස්කම් සහිතව තීරණය කරන ලදී. එක් එක් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවකින් (ඉහළ සිට දෙවන සහ තෙවන සම්පූර්ණයෙන්ම වර්ධනය වූ කොළ) කොළ ප්‍රතිකාරයෙන් පැය 72 කට පසු එකතු කරන ලදී (hpt). සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවකටම භාජන පහක් (බඳුනකට ශාක දෙකක්) ඇතුළත් විය. ක්‍රමයේ නිරවද්‍යතාවය, විශ්වසනීයත්වය සහ ප්‍රජනන හැකියාව සහතික කිරීම සඳහා සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක්ම අනුපිටපත් (තාක්ෂණික අනුපිටපත් දෙකක්) ලෙස විශ්ලේෂණය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, 0.01% බියුටයිලේටඩ් හයිඩ්‍රොක්සිටොලුයින් (BHT; සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්, ශාන්ත ලුවී, MO, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) අඩංගු 20% ට්‍රයික්ලෝරෝඇසිටික් අම්ලය (TCA; මිලිපෝර්සිග්මා, බර්ලින්ටන්, MA, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සමඟ MDA නිස්සාරණය සඳහා බිම් පත්‍ර පටක ග්‍රෑම් 0.5 ක් භාවිතා කරන ලදී. ඉන්පසු UV-160A වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (ෂිමාඩ්සු සංස්ථාව, ජපානය) භාවිතයෙන් 532 සහ 600 nm හි අවශෝෂණය මැනීමෙන් සුපිරි ද්‍රව්‍යයේ MDA අන්තර්ගතය වර්ණමිතිකව තීරණය කරන ලද අතර පසුව nmol g−1 FW ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලදී.
එන්සයිම නොවන සහ එන්සයිම ප්‍රතිඔක්සිකාරක තක්සේරු කිරීම සඳහා, ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු පැය 72 (hpt) හිදී එක් එක් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවකින් කොළ (ඉහළ සිට දෙවන සහ තෙවන සම්පූර්ණයෙන්ම වර්ධනය වූ කොළ) එකතු කරන ලදී. සෑම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක්ම භාජන පහකින් (බඳුනකට ශාක දෙකක්) සමන්විත විය. සෑම ජීව විද්‍යාත්මක සාම්පලයක්ම අනුපිටපත් වලින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (තාක්ෂණික සාම්පල දෙකක්). කොළ දෙකක් ද්‍රව නයිට්‍රජන් සමඟ අඹරා එන්සයිම සහ එන්සයිම නොවන ප්‍රතිඔක්සිකාරක, සම්පූර්ණ ඇමයිනෝ අම්ල, ප්‍රෝලීන් අන්තර්ගතය, ජාන ප්‍රකාශනය සහ ඔක්සලේට් ප්‍රමාණනය තීරණය කිරීම සඳහා සෘජුවම භාවිතා කරන ලදී.
Kahkonen et al. (1999) විසින් විස්තර කරන ලද ක්‍රමයේ සුළු වෙනස්කම් සහිතව Folin-Ciocalteu ප්‍රතික්‍රියාකාරකය (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ ද්‍රාව්‍ය ෆීනෝලික් තීරණය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, සමජාතීය පත්‍ර පටක ග්‍රෑම් 0.1 ක් පමණ අඳුරේ දී 20 ml 80% මෙතනෝල් සමඟ පැය 24 ක් නිස්සාරණය කරන ලද අතර කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමෙන් පසු සුපර්නේටන්ට් එකතු කරන ලදී. නියැදි සාරයේ මිලි ලීටර් 0.1 ක් ෆොලින්-Ciocalteu ප්‍රතික්‍රියාකාරකය (10%) මිලි ලීටර් 0.5 ක් සමඟ මිශ්‍ර කර තත්පර 30 ක් සොලවා විනාඩි 5 ක් අඳුරේ තබන ලදී. ඉන්පසු 20% සෝඩියම් කාබනේට් ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 0.5 ක් (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) සෑම නලයකටම එකතු කර, හොඳින් මිශ්‍ර කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් අඳුරේ දී ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසු, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයේ අවශෝෂණය UV-160A වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (ෂිමාඩ්සු සංස්ථාව, ජපානය) භාවිතයෙන් 765 nm හිදී මනිනු ලැබීය. සාම්පල සාරයන්හි මුළු ද්‍රාව්‍ය ෆීනෝල් ​​සාන්ද්‍රණය ගැලික් අම්ල ක්‍රමාංකන වක්‍රයක් (ෆිෂර් සයන්ටිෆික්, හැම්ප්ටන්, NH, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලද අතර නැවුම් බර ග්‍රෑම් එකකට ගැලික් අම්ලයට සමාන මිලිග්‍රෑම් ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලදී (mg GAE g-1 නැවුම් බර).
සුළු වෙනස්කම් සහිතව Djeridane et al. (2006) ගේ ක්‍රමයට අනුව මුළු ද්‍රාව්‍ය ෆ්ලේවනොයිඩ් අන්තර්ගතය තීරණය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, ඉහත මෙතනෝල් සාරය මිලි ලීටර් 0.3 ක් 5% ඇලුමිනියම් ක්ලෝරයිඩ් ද්‍රාවණයක මිලි ලීටර් 0.3 ක් (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) සමඟ මිශ්‍ර කර, දැඩි ලෙස කලවම් කර, පසුව කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 5 ක් ඉන්කියුබේට් කරන ලද අතර, පසුව 10% පොටෑසියම් ඇසිටේට් ද්‍රාවණයක මිලි ලීටර් 0.3 ක් (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) එකතු කර, හොඳින් මිශ්‍ර කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අඳුරේ විනාඩි 30 ක් ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයේ අවශෝෂණය UV-160A වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (Shimadzu Corporation, Japan) භාවිතයෙන් 430 nm හිදී මනිනු ලැබීය. සාම්පල සාරයන්හි මුළු ද්‍රාව්‍ය ෆ්ලේවනොයිඩ් සාන්ද්‍රණය රූටින් ක්‍රමාංකන වක්‍රයක් (TCI America, Portland, OR, USA) භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලද අතර පසුව නැවුම් බර ග්‍රෑම් එකකට රූටින් සමාන මිලිග්‍රෑම් ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලදී (mg RE g-1 නැවුම් බර).
බෝංචි කොළවල මුළු නිදහස් ඇමයිනෝ අම්ල අන්තර්ගතය තීරණය කරනු ලැබුවේ යොකොයාමා සහ හිරමට්සු (2003) විසින් යෝජනා කරන ලද සහ සන් සහ තවත් අය (2006) විසින් වෙනස් කරන ලද ක්‍රමය මත පදනම්ව, වෙනස් කරන ලද නින්හයිඩ්‍රින් ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් (තර්මෝ සයන්ටිෆික් කෙමිකල්ස්, වෝල්තම්, එම්ඒ, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) භාවිතා කරමිනි. කෙටියෙන් කිවහොත්, බිම් පටක ග්‍රෑම් 0.1 ක් pH 5.4 බෆරයක් සමඟ නිස්සාරණය කරන ලද අතර, සුපර්නේටන්ට් 200 μL නින්හයිඩ්‍රින් 200 μL (2%) සහ පිරිඩීන් 200 μL (10%; ස්පෙක්ට්‍රම් කෙමිකල්, නිව් බ්‍රන්ස්වික්, නිව්ජේ, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කර, විනාඩි 30 ක් උතුරන ජල ස්නානයක තැන්පත් කර, පසුව සිසිල් කර UV-160A වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (ෂිමාඩ්සු සංස්ථාව, ජපානය) භාවිතයෙන් 580 nm ට මනිනු ලැබීය. අනෙක් අතට, ප්‍රෝලීන් බේට්ස් ක්‍රමය මගින් තීරණය කරන ලදී (බේට්ස් සහ තවත් අය, 1973). ප්‍රෝලීන් 3% සල්ෆොසැලිසිලික් අම්ලය (තර්මෝ සයන්ටිෆික් කෙමිකල්ස්, වෝල්තම්, එම්ඒ, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සමඟ නිස්සාරණය කරන ලද අතර කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමෙන් පසු, සුපර්නේටන්ට් මිලි ලීටර් 0.5 ක් ග්ලැසියර ඇසිටික් අම්ලය (ෆිෂර් සයන්ටිෆික්, හැම්ප්ටන්, එන්එච්, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සහ නින්හයිඩ්‍රින් ප්‍රතික්‍රියාකාරකය මිලි ලීටර් 1 ක් සමඟ මිශ්‍ර කර, 90°C දී විනාඩි 45 ක් පුර්ව ගන්වා, ඉහත සඳහන් වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානය භාවිතා කර 520 nm දී සිසිල් කර මනින ලදී. කොළ සාරයන්හි මුළු නිදහස් ඇමයිනෝ අම්ල සහ ප්‍රෝලීන් පිළිවෙලින් ග්ලයිසීන් සහ ප්‍රෝලීන් ක්‍රමාංකන වක්‍ර (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්, ශාන්ත ලුවී, MO, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලද අතර නැවුම් බර mg/g ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලදී.
ප්‍රතිඔක්සිකාරක එන්සයිමවල එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය තීරණය කිරීම සඳහා, 1 mM EDTA-Na2 (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්, ශාන්ත ලුවී, MO, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සහ 7.5% පොලිවයිනයිල්පිරොලිඩෝන් (PVP; සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්, ශාන්ත ලුවී, MO, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) අඩංගු 50 mM ට්‍රිස් බෆරයේ (pH 7.8) මිලි ලීටර් 3 ක් සමඟ සමජාතීය පටක මිලිග්‍රෑම් 500 ක් පමණ නිස්සාරණය කරන ලද අතර, ශීතකරණයක් යටතේ (4 °C) මිනිත්තු 20 ක් 10,000 × g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කර, සුපිරි (අමු එන්සයිම සාරය) එකතු කරන ලදී (එල්-නගර් සහ වෙනත් අය, 2023; ඔස්මාන් සහ වෙනත් අය, 2023). ඉන්පසු කැටලේස් (CAT) 0.1 M සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරයේ මිලි ලීටර් 2 ක් (pH 6.5; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්, ශාන්ත ලුවී, MO, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සහ 269 mM H2O2 ද්‍රාවණයේ 100 μl සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කර එහි එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය තීරණය කරන ලද්දේ Aebi (1984) ක්‍රමයට අනුව සුළු වෙනස්කම් සහිතවය (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Harrach et al. (2009) ක්‍රමය භාවිතයෙන් ගුවායිකොල්-යැපෙන පෙරොක්සිඩේස් (POX) එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය තීරණය කරන ලදී. (2008) සුළු වෙනස් කිරීම් සහිතව (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) සහ පොලිෆෙනෝල් ඔක්සිඩේස් (PPO) හි එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය තීරණය කරන ලද්දේ 100 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරයේ 2.2 ml (pH 6.0), ගුවායාකෝල් 100 μl (TCI රසායනික ද්‍රව්‍ය, පෝට්ලන්ඩ්, OR, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) සහ 12 mM H2O2 100 μl සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කිරීමෙන් පසුවය. මෙම ක්‍රමය (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ට වඩා තරමක් වෙනස් කරන ලදී. 0.1 M පොස්පේට් බෆරයේ (pH 6.0) නැවුම්ව සකස් කරන ලද කැටෙකෝල් ද්‍රාවණය (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) මිලි ලීටර් 3 ක් සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කිරීමෙන් පසුව විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. CAT ක්‍රියාකාරිත්වය 240 nm (A240) හිදී H2O2 වියෝජනය නිරීක්ෂණය කිරීමෙන් ද, POX ක්‍රියාකාරිත්වය 436 nm (A436) හිදී අවශෝෂණයේ වැඩිවීම නිරීක්ෂණය කිරීමෙන් ද, PPO ක්‍රියාකාරිත්වය 495 nm (A495) හිදී සෑම තත්පර 30 කට වරක් UV-160A වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (ෂිමාඩ්සු, ජපානය) භාවිතයෙන් මිනිත්තු 3 ක් සඳහා අවශෝෂණ උච්චාවචනයන් වාර්තා කිරීමෙන් ද මනිනු ලැබීය.
අවසාන ප්‍රතිකාරයෙන් පැය 72 කට පසු බෝංචි කොළවල (ඉහළ සිට දෙවන සහ තුන්වන සම්පූර්ණයෙන්ම වර්ධනය වූ කොළ) පෙරොක්සිසෝමල් කැටලේස් (PvCAT1; GenBank ප්‍රවේශ අංකය KF033307.1), සුපර් ඔක්සයිඩ් ඩිස්මියුටේස් (PvSOD; GenBank ප්‍රවේශ අංකය XM_068639556.1), සහ ග්ලූටතයෝන් රිඩක්ටේස් (PvGR; GenBank ප්‍රවේශ අංකය KY195009.1) ඇතුළු ප්‍රතිඔක්සිකාරක-ආශ්‍රිත ජාන තුනක පිටපත් මට්ටම් හඳුනා ගැනීමට තත්‍ය කාලීන RT-PCR භාවිතා කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලයට අනුව සරලව P මුළු RNA නිස්සාරණ කට්ටලය (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) භාවිතයෙන් RNA හුදකලා කරන ලදී. ඉන්පසු, නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව TOP script™ cDNA සංස්ලේෂණ කට්ටලය භාවිතයෙන් cDNA සංස්ලේෂණය කරන ලදී. ඉහත ජාන තුනේ ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙල අතිරේක වගුව S3 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. PvActin-3 (GenBank ප්‍රවේශ අංකය: XM_068616709.1) ගෘහ පාලන ජානය ලෙස භාවිතා කරන ලද අතර සාපේක්ෂ ජාන ප්‍රකාශනය 2-ΔΔCT ක්‍රමය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී (Livak සහ Schmittgen, 2001). ජෛව ආතතිය (පොදු රනිල කුලයට අයත් බෝග සහ ඇන්ත්‍රැක්නෝස් දිලීර කොලෙටෝට්‍රිකම් ලින්ඩෙමුතියනම් අතර නොගැලපෙන අන්තර්ක්‍රියා) සහ අජීවී ආතතිය (නියඟය, ලවණතාව, අඩු උෂ්ණත්වය) යටතේ ඇක්ටින් ස්ථායිතාව පෙන්නුම් කරන ලදී (Borges et al., 2012).
අපි මුලින්ම S. sclerotiorum හි ඔක්සලෝඇසිටේට් ඇසිටිල්හයිඩ්‍රොලේස් (OAH) ප්‍රෝටීන වල සිලිකෝ විශ්ලේෂණයේ ජෙනෝමය පුරා ප්‍රෝටීන විශ්ලේෂණයක් ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් BLAST මෙවලම (BLASTp 2.15.0+) භාවිතා කළෙමු (Altschul et al., 1997, 2005). කෙටියෙන් කිවහොත්, අපි Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank ප්‍රවේශ අංකය XP_040799428.1; 342 ඇමයිනෝ අම්ල) සහ Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank ප්‍රවේශ අංකය XP_056833920.1; 316 ඇමයිනෝ අම්ල) වෙතින් S. sclerotiorum හි සමජාතීය ප්‍රෝටීනය සිතියම්ගත කිරීම සඳහා විමසුම් අනුපිළිවෙලක් ලෙස භාවිතා කළෙමු (taxide: 5180). ජෛව තාක්‍ෂණ තොරතුරු සඳහා වූ ජාතික මධ්‍යස්ථානයේ (NCBI) වෙබ් අඩවිය වන http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ හි GenBank හි මෑතකදී ලබා ගත හැකි S. sclerotiorum ජෙනෝම දත්ත වලට එරෙහිව BLASTp සිදු කරන ලදී.
ඊට අමතරව, S. sclerotiorum (SsOAH) වෙතින් පුරෝකථනය කරන ලද OAH ජානය සහ A. fijiensis CBS 313.89 වෙතින් AfOAH හි පරිණාමීය විශ්ලේෂණය සහ ෆයිලොජෙනටික් ගස සහ P. lagena වෙතින් PlOAH අනුකෘතිය මත පදනම් වූ MEGA11 (Tamura et al., 2021) සහ JTT matrix-පාදක ආකෘතිය (Jones et al., 1992) හි උපරිම සම්භාවිතා ක්‍රමය භාවිතා කරමින් අනුමාන කරන ලදී. S. sclerotiorum වෙතින් පුරෝකථනය කරන ලද සියලුම OAH ජානවල (SsOAH) ප්‍රෝටීන් අනුපිළිවෙලෙහි බහු පෙළගැස්වීමේ විශ්ලේෂණය සහ සීමා-පාදක පෙළගැස්වීමේ මෙවලම (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) භාවිතයෙන් විමසුම් අනුපිළිවෙල සමඟ ෆයිලොජෙනටික් ගස ඒකාබද්ධ කරන ලදී (Papadopoulos සහ Agarwala, 2007). ඊට අමතරව, S. sclerotiorum වෙතින් SsOAH හි හොඳම ගැළපෙන ඇමයිනෝ අම්ල අනුපිළිවෙල, ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) භාවිතයෙන් විමසුම් අනුපිළිවෙල (AfOAH සහ PlOAH) (Larkin et al., 2007) සමඟ පෙළගස්වන ලද අතර, පෙළගැස්මේ සංරක්ෂිත කලාප ESPript මෙවලම (අනුවාදය 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) භාවිතයෙන් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.
තවද, S. sclerotiorum SsOAH හි පුරෝකථනය කරන ලද ක්‍රියාකාරී නියෝජිත වසම් සහ සංරක්ෂිත අඩවි, InterPro මෙවලම (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) භාවිතයෙන් විවිධ පවුල්වලට අන්තර්ක්‍රියාකාරීව වර්ගීකරණය කරන ලදී (Blum et al., 2021). අවසාන වශයෙන්, පුරෝකථනය කරන ලද S. sclerotiorum SsOAH හි ත්‍රිමාණ (3D) ව්‍යුහ ආකෘති නිර්මාණය ප්‍රෝටීන් සමජාතීය විද්‍යාව/සමාන හඳුනාගැනීමේ එන්ජිම (Phyre2 සේවාදායක අනුවාදය 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලද අතර SWISS-MODEL සේවාදායකය (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) භාවිතයෙන් වලංගු කරන ලදී. පුරෝකථනය කරන ලද ත්‍රිමාණ ව්‍යුහයන් (PDB ආකෘතිය) UCSF-Chimera පැකේජය (අනුවාදය 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) භාවිතයෙන් අන්තර්ක්‍රියාකාරීව දෘශ්‍යකරණය කරන ලදී (Pettersen et al., 2004).
ස්ක්ලෙරෝටීනියා ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් හි මයිසීලියාවේ ඔක්සලෝඇසිටේට් ඇසිටිල්හයිඩ්‍රොලේස් (SsOAH; GenBank ප්‍රවේශ අංකය: XM_001590428.1) පිටපත් කිරීමේ මට්ටම තීරණය කිරීම සඳහා ප්‍රමාණාත්මක තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත PCR භාවිතා කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් PDB අඩංගු ෆ්ලාස්කුවකට එන්නත් කර සෙලවෙන ඉන්කියුබේටරයක (ආකෘතිය: I2400, නිව් බ්‍රන්ස්වික් සයන්ටිෆික් සමාගම, එඩිසන්, NJ, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) 25 ± 2 °C දී පැය 24 ක් 150 rpm දී සහ නිරන්තර අන්ධකාරයේ (පැය 24) මයිසීලියල් වර්ධනය උත්තේජනය කිරීම සඳහා තබා ඇත. ඉන්පසුව, සෛල අවසාන IC50 සාන්ද්‍රණයන්හි (පිළිවෙලින් ආසන්න වශයෙන් 40 සහ 3.2 mg/L) L-ornithine සහ දිලීර නාශක Rizolex-T සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර පසුව එම කොන්දේසි යටතේ තවත් පැය 24 ක් වගා කරන ලදී. ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු, සංස්කෘතීන් මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 2500 rpm හි කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලද අතර ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය සඳහා සුපර්නේටන්ට් (දිලීර මයිසිලියම්) එකතු කරන ලදී. ඒ හා සමානව, ආසාදිත පටක මතුපිට සුදු පුස් සහ කපු වැනි මයිසිලියම් සෑදූ ආසාදිත ශාක වලින් ආසාදනයෙන් පසු 0, 24, 48, 72, 96 සහ 120 පැය වලදී දිලීර මයිසිලියම් එකතු කරන ලදී. දිලීර මයිසිලියම් වලින් RNA නිස්සාරණය කරන ලද අතර පසුව ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි cDNA සංස්ලේෂණය කරන ලදී. SsOAH සඳහා ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙල අතිරේක වගුව S3 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත. SsActin (GenBank ප්‍රවේශ අංකය: XM_001589919.1) ගෘහ පාලන ජානය ලෙස භාවිතා කරන ලද අතර, සාපේක්ෂ ජාන ප්‍රකාශනය 2-ΔΔCT ක්‍රමය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී (Livak සහ Schmittgen, 2001).
Xu සහ Zhang (2000) ගේ ක්‍රමයට අනුව සුළු වෙනස්කම් සහිතව අර්තාපල් ඩෙක්ස්ට්‍රෝස් සුප් හොද්ද (PDB) සහ දිලීර රෝග කාරකය වන Sclerotinia sclerotiorum අඩංගු ශාක සාම්පලවල ඔක්සලික් අම්ලය තීරණය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, S. sclerotiorum හුදකලා PDB අඩංගු ෆ්ලාස්ක් වලට එන්නත් කර, පසුව සෙලවෙන ඉන්කියුබේටරයක (ආකෘතිය I2400, නිව් බ්‍රන්ස්වික් සයන්ටිෆික් සමාගම, එඩිසන්, NJ, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) 150 rpm දී 25 ± 2 °C දී mycelial වර්ධනය උත්තේජනය කිරීම සඳහා දින 3-5 ක් නිරන්තර අන්ධකාරයේ (පැය 24) වගා කරන ලදී. ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු, දිලීර සංස්කෘතිය මුලින්ම Whatman #1 පෙරහන් කඩදාසි හරහා පෙරා, පසුව අවශේෂ mycelium ඉවත් කිරීම සඳහා මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 2500 rpm දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. ඔක්සලේට් තවදුරටත් ප්‍රමාණාත්මකව තීරණය කිරීම සඳහා සුපිරි ද්‍රව්‍ය එකතු කර 4°C දී ගබඩා කරන ලදී. ශාක සාම්පල සකස් කිරීම සඳහා, ශාක පටක කොටස් ආසන්න වශයෙන් 0.1 ග්රෑම් ආසවනය කළ ජලය (එක් එක් වරකට මිලි ලීටර් 2) සමඟ තුන් වරක් නිස්සාරණය කරන ලදී. ඉන්පසු සාම්පල විනාඩි 5ක් 2500 rpm හි කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලද අතර, සුපිරි ද්‍රව්‍යය Whatman අංක 1 පෙරහන් කඩදාසිය හරහා වියළි පෙරීම කර වැඩිදුර විශ්ලේෂණය සඳහා එකතු කරන ලදී.
ඔක්සලික් අම්ලයේ ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය සඳහා, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය වීදුරු නැවතුම් නළයක පහත අනුපිළිවෙලින් සකස් කරන ලදී: සාම්පලයෙන් මිලි ලීටර් 0.2 (හෝ PDB සංස්කෘතික පෙරහන හෝ ඔක්සලික් අම්ල සම්මත ද්‍රාවණය), බ්‍රෝමොෆෙනෝල් නිල් මිලි ලීටර් 0.11 (BPB, 1 mM; ෆිෂර් කෙමිකල්, පිට්ස්බර්ග්, PA, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය), 1 M සල්ෆියුරික් අම්ලයෙන් මිලි ලීටර් 0.198 (H2SO4; අල්-ගොම්හෝරියා ඖෂධ සහ වෛද්‍ය සැපයුම්, කයිරෝ, ඊජිප්තුව) සහ 100 mM පොටෑසියම් ඩයික්‍රොමේට් (K2Cr2O7; TCI රසායනික ද්‍රව්‍ය, පෝට්ලන්ඩ්, OR, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) 0.176, ඉන්පසු ද්‍රාවණය ආසවනය කළ ජලය සමඟ මිලි ලීටර් 4.8 දක්වා තනුක කර, දැඩි ලෙස මිශ්‍ර කර වහාම 60 °C ජල ස්නානයක තබන ලදී. මිනිත්තු 10 කට පසු, සෝඩියම් හයිඩ්‍රොක්සයිඩ් ද්‍රාවණය (NaOH; 0.75 M) මිලි ලීටර් 0.5 ක් එකතු කිරීමෙන් ප්‍රතික්‍රියාව නතර කරන ලදී. ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයේ අවශෝෂණය (A600) UV-160 වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් (Shimadzu Corporation, Japan) භාවිතයෙන් 600 nm හිදී මනිනු ලැබීය. PDB සහ ආසවනය කළ ජලය පිළිවෙලින් සංස්කෘතික පෙරහන් සහ ශාක සාම්පල ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා පාලනයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. PDB මාධ්‍යයේ මිලිලීටරයකට ඔක්සලික් අම්ලයේ මයික්‍රොග්‍රෑම් ලෙස ප්‍රකාශිත සංස්කෘතික පෙරහන් වල ඔක්සලික් අම්ල සාන්ද්‍රණය (μg.mL−1) සහ නැවුම් බර ග්‍රෑම් එකකට ඔක්සලික් අම්ලයේ මයික්‍රොග්‍රෑම් ලෙස ප්‍රකාශිත කොළ සාරයන්හි ඔක්සලික් අම්ල ක්‍රමාංකන වක්‍රයක් භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලදී (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
අධ්‍යයනය පුරාවටම, සියලුම අත්හදා බැලීම් සම්පූර්ණයෙන්ම අහඹු ලෙස නිර්මාණය කර ඇති අතර, වෙනත් ආකාරයකින් සඳහන් නොකළහොත්, ප්‍රතිකාරයකට ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ හයක් සහ ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූවකට භාජන පහක් (බඳුනකට ශාක දෙකක්) ඇත. ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ අනුරූ අනුපිටපත් වලින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (තාක්ෂණික අනුරූ දෙකක්). එකම අත්හදා බැලීමේ ප්‍රතිනිෂ්පාදන හැකියාව පරීක්ෂා කිරීම සඳහා තාක්ෂණික අනුරූ භාවිතා කරන ලද නමුත් ව්‍යාජ අනුරූ වළක්වා ගැනීම සඳහා සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණයේදී භාවිතා නොකළේය. ටුකී-ක්‍රේමර් අවංකවම සැලකිය යුතු වෙනසක් (HSD) පරීක්ෂණයෙන් පසුව (p ≤ 0.05) විචලනය විශ්ලේෂණය (ANOVA) භාවිතයෙන් දත්ත සංඛ්‍යානමය වශයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. in vitro අත්හදා බැලීම් සඳහා, IC50 සහ IC99 අගයන් ප්‍රොබිට් ආකෘතිය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද අතර 95% විශ්වාසනීය අන්තරයන් ගණනය කරන ලදී.
ඊජිප්තුවේ එල් ගබියා ප්‍රාන්තයේ විවිධ සෝයා බෝංචි ක්ෂේත්‍රවලින් හුදකලා හතරක් එකතු කරන ලදී. PDA මාධ්‍යයේදී, සියලුම හුදකලා කිරීම් ක්‍රීම් සුදු මයිසිලියම් නිපදවූ අතර ඒවා ඉක්මනින් කපු සුදු පැහැයට හැරේ (රූපය 1A) සහ පසුව ස්ක්ලෙරෝටියම් අවධියේදී ලා දුඹුරු හෝ දුඹුරු පැහැයට හැරේ. ස්ක්ලෙරෝටියා සාමාන්‍යයෙන් ඝන, කළු, ගෝලාකාර හෝ අක්‍රමවත් හැඩයකින් යුක්ත වන අතර, දිග 5.2 සිට 7.7 mm දක්වා සහ විෂ්කම්භය 3.4 සිට 5.3 mm දක්වා වේ (රූපය 1B). හුදකලා කිරීම් හතරක් දින 10-12 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසු වගා මාධ්‍යයේ කෙළවරේ ස්ක්ලෙරෝටියා ආන්තික රටාවක් වර්ධනය කළද (රූපය 1A), තහඩුවකට ස්ක්ලෙරෝටියා ගණන ඔවුන් අතර සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් විය (P < 0.001), හුදකලා 3 හි ඉහළම ස්ක්ලෙරෝටියා සංඛ්‍යාව (තහඩුවකට 32.33 ± 1.53 ස්ක්ලෙරෝටියා; රූපය 1C). ඒ හා සමානව, PDB හි අනෙකුත් හුදකලා වලට වඩා හුදකලා #3 ඔක්සලික් අම්ලය නිපදවීය (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; රූපය 1D). හුදකලා #3 ෆයිටොපාතොජනික් දිලීර Sclerotinia sclerotiorum හි සාමාන්‍ය රූප විද්‍යාත්මක සහ අන්වීක්ෂීය ලක්ෂණ පෙන්නුම් කළේය. උදාහරණයක් ලෙස, PDA හි, හුදකලා #3 හි ජනපද වේගයෙන් වර්ධනය විය, ක්‍රීම් සුදු විය (රූපය 1A), ප්‍රතිලෝම බීජ් හෝ ලා සැමන් කහ-දුඹුරු, සහ සෙන්ටිමීටර 9 ක විෂ්කම්භයක් සහිත තහඩුවක මතුපිට සම්පූර්ණයෙන්ම ආවරණය කිරීමට 25 ± 2°C දී දින 6-7 ක් අවශ්‍ය විය. ඉහත රූප විද්‍යාත්මක සහ අන්වීක්ෂීය ලක්ෂණ මත පදනම්ව, හුදකලා #3 Sclerotinia sclerotiorum ලෙස හඳුනා ගන්නා ලදී.
රූපය 1. සාමාන්‍ය රනිල කුලයට අයත් බෝග වලින් S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් හුදකලා වල ලක්ෂණ සහ ව්‍යාධිජනක බව. (A) PDA මාධ්‍යයේ S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් හුදකලා හතරක මයිසීයල් වර්ධනය, (B) S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් හුදකලා හතරක ස්ක්ලෙරෝටියෝරම්, (C) ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් ගණන (තහඩුවකට), (D) PDB මාධ්‍යයේ ඔක්සලික් අම්ල ස්‍රාවය (μg.mL−1), සහ (E) හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ ගොදුරු විය හැකි වාණිජ රනිල කුලයට අයත් වගාවක් වන Giza 3 හි S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම් හුදකලා හතරක රෝග බරපතලකම (%). අගයන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ පහක සාමාන්‍ය ± SD නියෝජනය කරයි (n = 5). විවිධ අකුරු ප්‍රතිකාර අතර සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (p < 0.05). (F–H) හුදකලා #3 (dpi) සමඟ එන්නත් කිරීමෙන් දින 10 කට පසු, පිළිවෙලින් භූගත කඳන් සහ සිලිකස් මත සාමාන්‍ය සුදු පුස් රෝග ලක්ෂණ දිස් විය. (I) S. sclerotiorum isolate #3 හි අභ්‍යන්තර පිටපත් කරන ලද spacer (ITS) කලාපයේ පරිණාමීය විශ්ලේෂණය උපරිම සම්භාවිතා ක්‍රමය භාවිතයෙන් සිදු කරන ලද අතර ජෛව තාක්‍ෂණ තොරතුරු සඳහා වූ ජාතික මධ්‍යස්ථානයේ (NCBI) දත්ත සමුදායෙන් ලබාගත් යොමු හුදකලා/වික්‍රියා 20 ක් සමඟ සංසන්දනය කරන ලදී (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). පොකුරු රේඛාවලට ඉහළින් ඇති සංඛ්‍යා කලාප ආවරණය (%) පෙන්නුම් කරන අතර, පොකුරු රේඛාවලට පහළින් ඇති සංඛ්‍යා ශාඛා දිග දක්වයි.
තවද, ව්යාධිජනක බව තහවුරු කිරීම සඳහා, හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ සංවේදී වාණිජ බෝංචි වගාවක් වන Giza 3 එන්නත් කිරීම සඳහා ලබාගත් S. sclerotiorum හුදකලා හතරක් භාවිතා කරන ලද අතර එය Koch ගේ උපකල්පනවලට අනුකූල වේ (රූපය 1E). ලබාගත් සියලුම දිලීර හුදකලා කිරීම් ව්යාධිජනක වූ අතර හරිත බෝංචි (cv. Giza 3) ආසාදනය කළ හැකි වුවද, සියලුම ඉහළ බිම් කොටස්වල (රූපය 1F) සාමාන්‍ය සුදු පුස් රෝග ලක්ෂණ ඇති කරයි, විශේෂයෙන් කඳන් (රූපය 1G) සහ කරල් (රූපය 1H) එන්නත් කිරීමෙන් දින 10 කට පසු (dpi), ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් දෙකක දී හුදකලා 3 වඩාත් ආක්‍රමණශීලී හුදකලාව විය. බෝංචි ශාක මත හුදකලා 3 හි ඉහළම රෝග බරපතලකම (%) තිබුණි (ආසාදනයෙන් පසු දින 7, 14 සහ 21 න් පිළිවෙලින් 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, සහ 76.7 ± 3.1; රූපය 1F).
අභ්‍යන්තර පිටපත් කරන ලද අවකාශකය (ITS) අනුක්‍රමණය මත පදනම්ව වඩාත් ආක්‍රමණශීලී S. sclerotiorum හුදකලාව #3 හඳුනා ගැනීම තවදුරටත් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 1I). හුදකලාව #3 සහ 20 යොමු හුදකලා/වික්‍රියා අතර ෆයිලොජෙනටික් විශ්ලේෂණය ඒවා අතර ඉහළ සමානකමක් (>99%) පෙන්නුම් කළේය. S. sclerotiorum හුදකලාව #3 (533 bp) වියළි කඩල බීජ වලින් හුදකලා කරන ලද ඇමරිකානු S. sclerotiorum හුදකලා LPM36 (GenBank ප්‍රවේශ අංකය MK896659.1; 540 bp) සහ වයලට් (Matthiola incana) කඳ කුණුවීමට හේතු වන චීන S. sclerotiorum හුදකලාව YKY211 (GenBank ප්‍රවේශ අංකය OR206374.1; 548 bp) සමඟ ඉහළ සමානකමක් ඇති බව සඳහන් කිරීම වටී, ඒ සියල්ල ඩෙන්ඩ්‍රොග්‍රෑම් මුදුනේ වෙන වෙනම කාණ්ඩගත කර ඇත (රූපය 1I). නව අනුපිළිවෙල NCBI දත්ත සමුදායේ තැන්පත් කර ඇති අතර එය "Sclerotinia sclerotiorum - isolate YN-25" (GenBank accession number PV202792) ලෙස නම් කර ඇත. 3 වන හුදකලාව වඩාත්ම ආක්‍රමණශීලී හුදකලාව බව දැකිය හැකිය; එබැවින්, මෙම හුදකලාව පසුකාලීන සියලුම අත්හදා බැලීම් වලදී අධ්‍යයනය සඳහා තෝරා ගන්නා ලදී.
S. sclerotiorum isolate 3 ට එරෙහිව විවිධ සාන්ද්‍රණයන්හිදී (12.5, 25, 50, 75, 100 සහ 125 mg/L) ඩයමයින් L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ප්‍රතිබැක්ටීරීය ක්‍රියාකාරිත්වය අභ්‍යන්තරව පරීක්ෂා කරන ලදී. L-ornithine ප්‍රතිබැක්ටීරීය බලපෑමක් ඇති කළ අතර මාත්‍රාව මත රඳා පවතින ආකාරයකින් S. sclerotiorum hyphae හි රේඩියල් වර්ධනය ක්‍රමයෙන් වළක්වන බව සැලකිය යුතු කරුණකි (රූපය 2A, B). පරීක්ෂා කරන ලද ඉහළම සාන්ද්‍රණයේදී (125 mg/L), L-ornithine ඉහළම මයිසීලියල් වර්ධන නිෂේධන අනුපාතය (99.62 ± 0.27%; රූපය 2B) පෙන්නුම් කළ අතර එය පරීක්ෂා කරන ලද ඉහළම සාන්ද්‍රණයේදී (10 mg/L) වාණිජ දිලීර නාශකයක් වන Rizolex-T (නිෂේධන අනුපාතය 99.45 ± 0.39%; රූපය 2C) ට සමාන විය, එය සමාන කාර්යක්ෂමතාවයක් පෙන්නුම් කරයි.
රූපය 2. Sclerotinia sclerotiorum වලට එරෙහිව L-ornithine හි in vitro ප්‍රතිබැක්ටීරීය ක්‍රියාකාරිත්වය. (A) S. sclerotiorum වලට එරෙහිව L-ornithine හි විවිධ සාන්ද්‍රණයන්ගේ ප්‍රතිබැක්ටීරීය ක්‍රියාකාරිත්වය වාණිජ දිලීර නාශක Rizolex-T (10 mg/L) සමඟ සංසන්දනය කිරීම. (B, C) පිළිවෙලින් L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 සහ 125 mg/L) හෝ Rizolex-T (2, 4, 6, 8 සහ 10 mg/L) හි විවිධ සාන්ද්‍රණයන් සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු S. sclerotiorum mycelial වර්ධනයේ නිෂේධන අනුපාතය (%). අගයන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ පහක මධ්‍යන්‍ය ± SD නියෝජනය කරයි (n = 5). විවිධ අකුරු ප්‍රතිකාර අතර සංඛ්‍යානමය වෙනස්කම් දක්වයි (p < 0.05). (D, E) පිළිවෙලින් L-ornithine සහ වාණිජ දිලීර නාශක Rizolex-T හි Probit ආකෘති ප්‍රතිගාමී විශ්ලේෂණය. ප්‍රොබිට් ආකෘති ප්‍රතිගාමී රේඛාව ඝන නිල් රේඛාවක් ලෙස දක්වා ඇති අතර, විශ්වාසනීය පරතරය (95%) ඉරි සහිත රතු රේඛාවක් ලෙස දක්වා ඇත.
ඊට අමතරව, ප්‍රොබිට් ප්‍රතිගාමී විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලද අතර අනුරූප බිම් කොටස් වගුව 1 සහ රූප 2D,E හි දක්වා ඇත. කෙටියෙන් කිවහොත්, L-ornithine හි පිළිගත හැකි බෑවුම් අගය (y = 2.92x − 4.67) සහ ඒ ආශ්‍රිත සැලකිය යුතු සංඛ්‍යාලේඛන (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 සහ p < 0.0001; රූපය 2D) වාණිජ දිලීර නාශකයක් වන Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 සහ p < 0.0001) හා සසඳන විට S. sclerotiorum වලට එරෙහිව වැඩි දියුණු කළ දිලීර නාශක ක්‍රියාකාරිත්වයක් පෙන්නුම් කළේය (වගුව 1).
වගුව 1. S. sclerotiorum වලට එරෙහිව L-ornithine සහ වාණිජ දිලීර නාශක "Rizolex-T" හි අර්ධ-උපරිම නිෂේධනීය සාන්ද්‍රණය (IC50) සහ IC99 (mg/l) අගයන්.
සමස්තයක් වශයෙන්, ප්‍රතිකාර නොකළ S. sclerotiorum-ආසාදිත ශාක හා සසඳන විට ප්‍රතිකාර කළ පොදු බෝංචි ශාකවල සුදු පුස් වර්ධනය සහ බරපතලකම L-ornithine (250 mg/L) සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය (පාලනය; රූපය 3A). කෙටියෙන් කිවහොත්, ප්‍රතිකාර නොකළ ආසාදිත පාලන ශාකවල රෝග බරපතලකම ක්‍රමයෙන් වැඩි වුවද (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, සහ 92.33 ± 3.06%), L-ornithine අත්හදා බැලීම පුරාවටම රෝගයේ බරපතලකම (%) සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, සහ 26.36 ± 3.07) ප්‍රතිකාරයෙන් පසු දින 7, 14 සහ 21 (dpt) හිදී (රූපය 3A). ඒ හා සමානව, S. sclerotiorum-ආසාදිත බෝංචි ශාක 250 mg/L L-ornithine සමඟ ප්‍රතිකාර කළ විට, ප්‍රතිකාර නොකළ පාලනයේදී රෝග ප්‍රගති වක්‍රය (AUDPC) යටතේ ඇති ප්‍රදේශය 1274.33 ± 33.13 සිට 281.03 ± 7.95 දක්වා අඩු විය, එය ධනාත්මක පාලන 50 mg/L Rizolex-T දිලීර නාශකයට වඩා තරමක් අඩු විය (183.61 ± 7.71; රූපය 3B). දෙවන අත්හදා බැලීමේදී ද එම ප්‍රවණතාවයම නිරීක්ෂණය විය.
රූපය. 3. හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ Sclerotinia sclerotiorum නිසා ඇති වන පොදු බෝංචි වල සුදු කුණුවීම වර්ධනය කිරීම සඳහා L-ornithine බාහිරව යෙදීමේ බලපෑම. (A) 250 mg/L L-ornithine සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු පොදු බෝංචි වල සුදු අච්චුවේ රෝග ප්‍රගති වක්‍රය (AUDPC) යටතේ ඇති ප්‍රදේශය. අගයන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ පහක මධ්‍යන්‍ය ± SD නියෝජනය කරයි (n = 5). විවිධ අකුරු ප්‍රතිකාර අතර සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (p < 0.05).
දින 42 කට පසු, 250 mg/L L-ornithine බාහිරව යෙදීමෙන් ශාක උස (රූපය 4A), ශාකයකට අතු ගණන (රූපය 4B) සහ ශාකයකට කොළ ගණන (රූපය 4C) ක්‍රමයෙන් වැඩි විය. වාණිජ දිලීර නාශකයක් වන Rizolex-T (50 mg/L) අධ්‍යයනය කරන ලද සියලුම පෝෂණ පරාමිතීන් කෙරෙහි විශාලතම බලපෑමක් ඇති කළ අතර, 250 mg/L L-ornithine බාහිරව යෙදීම ප්‍රතිකාර නොකළ පාලනයන්ට සාපේක්ෂව දෙවන විශාලතම බලපෑමක් ඇති කළේය (රූපය 4A–C). අනෙක් අතට, L-ornithine ප්‍රතිකාරය ප්‍රභාසංස්ලේෂක වර්ණක වන chlorophyll a (රූපය 4D) සහ chlorophyll b (රූපය 4E) වල අන්තර්ගතයට සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කළේ නැත, නමුත් සෘණ පාලනය (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) සහ ධනාත්මක පාලනය (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; රූපය 4F) හා සසඳන විට මුළු කැරොටිනොයිඩ් අන්තර්ගතය (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) තරමක් වැඩි විය. සමස්තයක් වශයෙන්, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ L-ornithine රනිල කුලයට අයත් බෝග සඳහා ශාක විෂ සහිත නොවන බවත් ඒවායේ වර්ධනය උත්තේජනය කළ හැකි බවත්ය.
රූපය 4. හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ Sclerotinia sclerotiorum ආසාදිත බෝංචි කොළ වල වර්ධන ලක්ෂණ සහ ප්‍රභාසංස්ලේෂක වර්ණක මත බාහිර L-ornithine යෙදීමේ බලපෑම. (A) ශාක උස (cm), (B) ශාකයකට අතු ගණන, (C) ශාකයකට කොළ ගණන, (D) Chlorophyll a අන්තර්ගතය (mg g-1 fr wt), (E) Chlorophyll b අන්තර්ගතය (mg g-1 fr wt), (F) මුළු කැරොටිනොයිඩ් අන්තර්ගතය (mg g-1 fr wt). අගයන් යනු ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ පහක මධ්‍යන්‍ය ± SD වේ (n = 5). විවිධ අකුරු ප්‍රතිකාර අතර සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (p < 0.05).
ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂ (ROS; හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් [H2O2] ලෙස ප්‍රකාශිත) සහ නිදහස් රැඩිකලුන් (සුපර් ඔක්සයිඩ් ඇනායන [O2•−] ලෙස ප්‍රකාශිත) ස්ථානීය හිස්ටොරෙමිකල් ප්‍රාදේශීයකරණයෙන් හෙළි වූයේ L-ornithine (250 mg/L) බාහිරව යෙදීමෙන් H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; රූපය 5A) සහ O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; රූපය 5B) සමුච්චය වීම සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළ බවයි. ප්‍රතිකාර නොකළ ආසාදිත ශාක (පිළිවෙලින් 173.31 ± 12.06 සහ 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) සහ වාණිජ දිලීර නාශක Rizolex-T (170.12 ± 9.50 සහ 157.00 ± 7.81) 50 mg/L සමඟ ප්‍රතිකාර කළ ශාක දෙකෙහිම සමුච්චය වීම හා සසඳන විට. පිළිවෙලින් nmol.g−1 fr wt) පැය 72 කදී. hpt යටතේ රැස් කරගත් H2O2 සහ O2•− ඉහළ මට්ටම් (රූපය 5A, B). ඒ හා සමානව, TCA-පාදක මැලොන්ඩියල්ඩිහයිඩ් (MDA) පරීක්ෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ S. ස්ක්ලෙරෝටියෝරම්-ආසාදිත බෝංචි ශාක ඒවායේ කොළවල MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) ඉහළ මට්ටම් රැස් කර ඇති බවයි (රූපය 5C). කෙසේ වෙතත්, L-ornithine බාහිරව යෙදීමෙන් ලිපිඩ පෙරොක්සිකරණය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වූ අතර එය ප්‍රතිකාර කළ ශාකවල MDA අන්තර්ගතය අඩු වීමෙන් (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) පෙන්නුම් කරයි.
රූපය 5. හරිතාගාර තත්වයන් යටතේ ආසාදනයෙන් පසු පැය 72 තුළ S. sclerotiorum ආසාදිත බෝංචි කොළ වල ඔක්සිකාරක ආතතිය සහ එන්සයිම නොවන ප්‍රතිඔක්සිකාරක ආරක්ෂක යාන්ත්‍රණවල ප්‍රධාන සලකුණු මත බාහිර L-ornithine යෙදීමේ බලපෑම. (A) හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt දී, (B) සුපර් ඔක්සයිඩ් ඇනායන (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt දී, (C) මැලොන්ඩියල්ඩිහයිඩ් (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt දී, (D) මුළු ද්‍රාව්‍ය ෆීනෝල් ​​(mg GAE g−1 FW) 72 hpt දී, (E) මුළු ද්‍රාව්‍ය ෆ්ලේවනොයිඩ් (mg RE g−1 FW) 72 hpt දී, (F) මුළු නිදහස් ඇමයිනෝ අම්ල (mg g−1 FW) 72 hpt දී සහ (G) ප්‍රෝලීන් අන්තර්ගතය (mg g−1 FW) 72 hpt දී. අගයන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ 5 ක (n = 5) මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය (මධ්‍යන්‍ය ± SD) නියෝජනය කරයි. විවිධ අකුරු ප්‍රතිකාර අතර සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (p < 0.05).