වර්තමානය *වත්මන් ලිපිනය: කොලෝන් 50931, ජර්මනිය, වයස්ගත වීම හා සම්බන්ධ රෝග වල සෛලීය ආතති ප්‍රතිචාරය පිළිබඳ කොලෝන් විශිෂ්ටතා පර්ෂද පර්යේෂණ (CECAD).
මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රෝග වල ස්නායු පරිහානිය ආපසු හැරවිය නොහැකි යැයි සැලකේ, මන්ද නියුරෝන වල පරිවෘත්තීය ප්ලාස්ටික් බව සීමිතය, නමුත් ශරීරයේ ස්නායු පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියේ සෛල ස්වාධීනත්වයට මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයේ බලපෑම දුර්වල ලෙස වටහාගෙන ඇත. මෙහිදී, බාධාකාරී මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විලයන ගතිකතාවයන් නිසා ඇතිවන ප්‍රගතිශීලී OXPHOS ඌනතාවය සහිත පර්කින්ජේ නියුරෝන වල සෛල-විශේෂිත ප්‍රෝටෝමය අපි හඳුන්වා දෙන්නෙමු. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවය ප්‍රෝටෝමික්ස් ක්ෂේත්‍රයේ ගැඹුරු වෙනසක් ඇති කළ බව අපට පෙනී ගිය අතර, එය අවසානයේ සෛල මරණයට පෙර නිශ්චිත පරිවෘත්තීය වැඩසටහන් අනුක්‍රමිකව සක්‍රීය කිරීමට හේතු විය. අනපේක්ෂිත ලෙස, TCA චක්‍රයේ අතරමැදි වලට අතිරේකව සපයන පයිරුවේට් කාබොක්සිලේස් (PCx) සහ අනෙකුත් වයස්ගත වීම වැළැක්වීමේ එන්සයිමවල පැහැදිලි ප්‍රේරණය අපි තීරණය කළෙමු. PCx නිෂේධනය කිරීමෙන් ඔක්සිකාරක ආතතිය සහ ස්නායු පරිහානිය උග්‍ර වූ අතර, එමඟින් OXPHOS නොමැති නියුරෝන වල ධමනි සිහින් වීම ආරක්ෂිත බලපෑමක් ඇති බව පෙන්නුම් කරයි. අවසාන වශයෙන් පරිහානියට පත් වූ නියුරෝන වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විලයනය ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීම මෙම පරිවෘත්තීය ලක්ෂණ සම්පූර්ණයෙන්ම ආපසු හරවන අතර එමඟින් සෛල මරණය වළක්වයි. අපගේ සොයාගැනීම් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයට ඔරොත්තු දීමේ හැකියාව ලබා දෙන කලින් නොදන්නා මාර්ග හඳුනාගෙන ඇති අතර රෝගයේ ප්‍රමාද අවධියේදී පවා ස්නායු පරිහානිය ආපසු හැරවිය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි.
ස්නායු ශක්ති පරිවෘත්තීය පවත්වා ගැනීම සඳහා මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ කේන්ද්‍රීය කාර්යභාරය අවධාරණය කරනු ලබන්නේ මිනිස් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රෝග හා සම්බන්ධ පුළුල් ස්නායු රෝග ලක්ෂණ මගිනි. මෙම රෝග බොහොමයක් ඇති වන්නේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාන ප්‍රකාශනය නියාමනය කරන ජාන විකෘති (1, 2) හෝ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගතිකත්වයට අදාළ ජාන විනාශය නිසා වන අතර එය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA (mtDNA) හි ස්ථායිතාවයට වක්‍රව බලපායි (3, 4). සත්ව ආකෘතිවල වැඩ කිරීමෙන් පෙන්නුම් කර ඇත්තේ අවට පටක වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයට ප්‍රතිචාර වශයෙන්, ගතානුගතික පරිවෘත්තීය මාර්ග (5-7) සක්‍රිය කළ හැකි බවයි, එමඟින් මෙම සංකීර්ණ රෝග වල ව්‍යාධිජනකය පිළිබඳ ගැඹුරු අවබෝධයක් සඳහා වැදගත් තොරතුරු සපයයි. ඊට හාත්පසින්ම වෙනස්ව, මොළයේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඇඩෙනොසීන් ට්‍රයිපොස්පේට් (ATP) නිෂ්පාදනයේ සාමාන්‍ය අසාර්ථකත්වය නිසා ඇති වන නිශ්චිත සෛල වර්ගවල පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් පිළිබඳ අපගේ අවබෝධය මූලික වේ (8), රෝග වැළැක්වීමට හෝ වැළැක්වීමට භාවිතා කළ හැකි චිකිත්සක ඉලක්ක හඳුනා ගැනීමේ අවශ්‍යතාවය අවධාරණය කරයි. ස්නායු පරිහානිය වැළැක්වීම (9). තොරතුරු නොමැතිකම යනු අවට පටක වල සෛල වර්ග හා සසඳන විට ස්නායු සෛල ඉතා සීමිත පරිවෘත්තීය නම්‍යශීලී බවක් ඇති බව බහුලව සැලකේ (10). උපාගමික සම්ප්‍රේෂණය ප්‍රවර්ධනය කිරීම සහ තුවාල හා රෝග තත්වයන්ට ප්‍රතිචාර දැක්වීම සඳහා නියුරෝන වලට පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය සැපයීම සම්බන්ධීකරණය කිරීමේදී මෙම සෛල ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බැවින්, මොළයේ පටක වල අභියෝගාත්මක තත්වයන්ට සෛල පරිවෘත්තීය අනුවර්තනය කිරීමේ හැකියාව ග්ලියල් සෛල වලට පමණක් සීමා වේ (11-14). ඊට අමතරව, මොළයේ පටක වල ආවේණික සෛලීය විෂමතාවය නිශ්චිත ස්නායු උප කාණ්ඩවල සිදුවන පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් අධ්‍යයනය කිරීමට බොහෝ දුරට බාධා කරයි. එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස, නියුරෝන වල මයිටොකොන්ඩ්‍රීය අක්‍රියතාවයේ නිශ්චිත සෛලීය සහ පරිවෘත්තීය ප්‍රතිවිපාක පිළිබඳව දන්නේ අල්ප වශයෙනි.
මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයේ පරිවෘත්තීය ප්‍රතිවිපාක තේරුම් ගැනීම සඳහා, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පිටත පටල විලයනය (Mfn2) විනාශ වීම නිසා ඇතිවන ස්නායු පරිහානියේ විවිධ අවස්ථා වලදී අපි පර්කින්ජේ නියුරෝන (PNs) හුදකලා කළෙමු. මිනිසුන් තුළ Mfn2 විකෘති චාර්කොට්-මාරි-ටූත් වර්ගය 2A (15) ලෙස හඳුන්වන පාරම්පරික මෝටර් සංවේදක ස්නායු රෝගයක් සමඟ සම්බන්ධ වුවද, මීයන් තුළ Mfn2 හි කොන්දේසි සහිත විනාශය යනු ඔක්සිකරණ පොස්පරයිලේෂන් (OXPHOS) අක්‍රියතාවයේ හොඳින් හඳුනාගත් ප්‍රේරණයකි. විවිධ ස්නායු උප වර්ග (16-19) සහ එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ඇතිවන ස්නායු පරිහානියේ සංසිද්ධිය චලන ආබාධ (18, 19) හෝ මස්තිෂ්ක ඇටැක්සියා (16) වැනි ප්‍රගතිශීලී ස්නායු රෝග ලක්ෂණ සමඟ ඇත. ලේබල්-නිදහස් ප්‍රමාණාත්මක (LFQ) ප්‍රෝටියෝමික්ස්, පරිවෘත්තීය විද්‍යාව, ප්‍රතිබිම්බකරණය සහ වෛරස් විද්‍යාත්මක ක්‍රමවල සංයෝජනයක් භාවිතා කිරීමෙන්, ප්‍රගතිශීලී ස්නායු පරිහානිය පයිරුවේට් කාබොක්සිලේස් (PCx) සහ PN වල ධමනි ස්ක්ලෙරෝසිස් වලට සම්බන්ධ අනෙකුත් සාධක දැඩි ලෙස ඇති කරන බව අපි පෙන්වමු. එන්සයිම ප්‍රකාශනය. මෙම සොයාගැනීමේ අදාළත්වය සත්‍යාපනය කිරීම සඳහා, අපි Mfn2-ඌනතාවයෙන් පෙළෙන PN වල PCx ප්‍රකාශනය විශේෂයෙන් අඩු-නියාමනය කළ අතර, මෙම මෙහෙයුම ඔක්සිකාරක ආතතිය උග්‍ර කරන බවත් ස්නායු පරිහානිය වේගවත් කරන බවත් සොයා ගත් අතර, එමඟින් azoospermia සෛල මරණයට පරිවෘත්තීය අනුවර්තනය ලබා දෙන බව ඔප්පු විය. MFN2 හි දැඩි ප්‍රකාශනය දරුණු OXPHOS ඌනතාවය, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA විශාල වශයෙන් පරිභෝජනය කිරීම සහ පෙනෙන පරිදි කැඩුණු මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාලය සමඟ පර්යන්ත පරිහානිය PN සම්පූර්ණයෙන්ම ගලවා ගත හැකි අතර, මෙම ස්නායු පරිහානියට සෛල මරණයට පෙර රෝගයේ දියුණු අවධියේදී පවා සුවය ලබා ගත හැකි බව තවදුරටත් අවධාරණය කරයි.
Mfn2 knockout PN වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියා දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා, අපි Cre-යැපෙන මයිටොකොන්ඩ්‍රියා කහ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (YFP) (mtYFP) (20) ඉලක්ක කර ගැනීමට ඉඩ සලසන මූසික වික්‍රියාවක් භාවිතා කළෙමු. Cre ප්‍රකාශනය සහ vivo තුළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා රූප විද්‍යාව පරීක්ෂා කළෙමු. PN වල Mfn2 ජානය විනාශ වීම මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ජාලයේ ක්‍රමයෙන් බෙදීමට හේතු වන බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය S1A), සහ මුල්ම වෙනස සති 3 දී සොයා ගන්නා ලදී. ඊට වෙනස්ව, කැල්බින්ඩින් ප්‍රතිශක්තිකරණ වර්ණ ගැන්වීම නැතිවීමෙන් පෙන්නුම් කරන පරිදි, PN සෛල ස්ථරයේ සැලකිය යුතු පරිහානිය වයස සති 12 දක්වා ආරම්භ නොවීය (රූපය 1, A සහ ​​B). මයිටොකොන්ඩ්‍රියා රූප විද්‍යාවේ මුල්ම වෙනස්කම් සහ ස්නායු මරණයේ දෘශ්‍යමාන ආරම්භය අතර කාල නොගැලපීම සෛල මරණයට පෙර මයිටොකොන්ඩ්‍රියා අක්‍රියතාවයෙන් අවුලුවන පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් විමර්ශනය කිරීමට අපව පොළඹවන ලදී. YFP (YFP+)-ප්‍රකාශිත PN හුදකලා කිරීම සඳහා අපි ප්‍රතිදීප්ත-සක්‍රිය සෛල වර්ග කිරීම (FACS)-පාදක උපාය මාර්ගයක් සකස් කළෙමු (රූපය 1C), සහ පාලන මීයන් තුළ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), මෙතැන් සිට CTRL (රූපය S1B) ලෙස හැඳින්වේ. YFP සංඥාවේ සාපේක්ෂ තීව්‍රතාවය මත පදනම් වූ ගේටින් උපාය මාර්ගයේ ප්‍රශස්තිකරණය මඟින් PN වල YFP+ ශරීරය (YFPhigh) PN නොවන (YFPneg) (රූපය S1B) හෝ අනුමාන ප්‍රතිදීප්ත අක්ෂය/ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කොටස් (YFPlow; රූපය S1D, වමේ), confocal අන්වීක්ෂය මගින් තහවුරු කර ඇත (රූපය S1D, දකුණ). වර්ගීකරණය කරන ලද ජනගහනයේ අනන්‍යතාවය සත්‍යාපනය කිරීම සඳහා, අපි LFQ ප්‍රෝටියොමික්ස් සහ පසුව ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය සිදු කළ අතර, YFPhigh සහ YFPneg සෛල අතර පැහැදිලි වෙන්වීමක් ඇති බව සොයා ගත්තෙමු (රූපය S1C). YFPhigh සෛල දන්නා PN සලකුණු (එනම් Calb1, Pcp2, Grid2 සහ Itpr3) හි ශුද්ධ පොහොසත් කිරීමක් පෙන්නුම් කළේය (21, 22), නමුත් නියුරෝන හෝ වෙනත් සෛල වර්ගවල බහුලව ප්‍රකාශ වන ප්‍රෝටීන පොහොසත් කිරීමක් නොමැත (රූපය 1D). ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් වලදී එකතු කරන ලද වර්ගීකරණය කරන ලද YFPhigh සෛලවල සාම්පල අතර සංසන්දනයක් සහසම්බන්ධතා සංගුණකය> 0.9 පෙන්නුම් කළ අතර, ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ අතර හොඳ ප්‍රතිනිෂ්පාදන හැකියාවක් පෙන්නුම් කරයි (රූපය S1E). සාරාංශයක් ලෙස, මෙම දත්ත ශක්‍ය PN හි උග්‍ර සහ නිශ්චිත හුදකලාව සඳහා අපගේ සැලැස්ම වලංගු කළේය. භාවිතා කරන ලද L7-cre ධාවක පද්ධතිය දරු ප්‍රසූතියෙන් පසු පළමු සතිය තුළ මොසෙයික් නැවත එකතු කිරීම ප්‍රේරණය කරන බැවින් (23), අපි CTRL සහ කොන්දේසි සහිත (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) වලින් මීයන් ඉවත් කිරීමට පටන් ගත්තෙමු. නැවත එකතු කිරීම අවසන් වූ පසු, එය සති 4 දී Mfn2cKO ලෙස හැඳින්වේ. අවසාන ලක්ෂ්‍යය ලෙස, පැහැදිලි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඛණ්ඩනය තිබියදීත් PN ස්ථරය නොවෙනස්ව පැවති සති 8 ක වයස අපි තෝරා ගත්තෙමු (රූපය 1B සහ රූපය S1A). සමස්තයක් වශයෙන්, අපි ප්‍රෝටීන 3013 ක් ප්‍රමාණනය කළ අතර, ඉන් 22% ක් පමණ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ප්‍රෝටෝමය මත පදනම් වූ මයිටොකාටා 2.0 විවරණ මත පදනම් විය (රූපය 1E) (රූපය 1E) (24). 8 වන සතියේ සිදු කරන ලද අවකල ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ සියලුම ප්‍රෝටීන වලින් 10.5% ක් පමණක් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් ඇති බවයි (රූපය 1F සහ රූපය S1F), එයින් ප්‍රෝටීන 195 ක් පහළට නියාමනය කර ඇති අතර ප්‍රෝටීන 120 ක් ඉහළට නියාමනය කර ඇත (රූපය 1F). මෙම දත්ත කට්ටලයේ "නවෝත්පාදන මාර්ග විශ්ලේෂණය" පෙන්නුම් කරන්නේ අවකලනය ලෙස ප්‍රකාශිත ජාන ප්‍රධාන වශයෙන් නිශ්චිත පරිවෘත්තීය මාර්ග සීමිත කට්ටලයකට අයත් බවයි (රූපය 1G). සිත්ගන්නා කරුණ නම්, OXPHOS සහ කැල්සියම් සංඥාකරණයට අදාළ මාර්ග අඩු කිරීම මගින් විලයන-ඌණ PN වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයේ ප්‍රේරණය තහවුරු වුවද, ප්‍රධාන වශයෙන් ඇමයිනෝ අම්ල පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ අනෙකුත් කාණ්ඩ සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවා ඇති අතර, එය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් PN වල සිදුවන පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට අනුකූල වේ. නැවත රැහැන් ඇදීම ස්ථාවරයි. අක්‍රිය වීම.
(A) CTRL සහ Mfn2cKO මීයන්ගේ මස්තිෂ්ක කොටස්වල නියෝජිත සංවෘත ඡායාරූප PNs (calbindin, අළු) ප්‍රගතිශීලී පාඩුව පෙන්නුම් කරයි; න්‍යෂ්ටීන් DAPI සමඟ ප්‍රති-පැහැ ගැන්වූහ. (B) (A) ප්‍රමාණනය (විචලනය පිළිබඳ ඒක-මාර්ග විශ්ලේෂණය, ***P<0.001; n = මීයන් තුනකින් කව 4 සිට 6 දක්වා). (C) පර්යේෂණාත්මක වැඩ ප්‍රවාහය. (D) පර්කින්ජේ (ඉහළ) සහ අනෙකුත් සෛල වර්ග (මැද) සඳහා විශේෂිත සලකුණු වල තාප සිතියම් ව්‍යාප්තිය. (E) වර්ගීකරණය කරන ලද PN හි හඳුනාගත් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ප්‍රෝටීන ගණන පෙන්වන වෙන් රූප සටහන. (F) සති 8 දී Mfn2cKO නියුරෝන වල වෙනස් ලෙස ප්‍රකාශිත ප්‍රෝටීන වල ගිනි කඳු කුමන්ත්‍රණය (වැදගත්කම කපා හැරීමේ අගය 1.3). (G) නිර්මාණාත්මක මාර්ග විශ්ලේෂණය සති 8 ලෙස වර්ගීකරණය කර ඇති Mfn2cKO PN හි වඩාත් වැදගත් ඉහළ-නියාමනය (රතු) සහ පහළ-නියාමනය (නිල්) මාර්ග පහ පෙන්වයි. එක් එක් අනාවරණය කරගත් ප්‍රෝටීනයේ සාමාන්‍ය ප්‍රකාශන මට්ටම පෙන්වා ඇත. අළු පරිමාණ තාප සිතියම: සකස් කළ P අගය. ns, වැදගත් නොවේ.
ප්‍රෝටියොමික්ස් දත්තවලින් පෙනී ගියේ I, III සහ IV සංකීර්ණවල ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය ක්‍රමයෙන් අඩු වූ බවයි. I, III සහ IV සංකීර්ණ සියල්ලෙහිම අත්‍යවශ්‍ය mtDNA-කේතනය කරන ලද උප ඒකක අඩංගු වූ අතර, න්‍යෂ්ටික-කේතනය කරන ලද සංකීර්ණ II මූලික වශයෙන් බලපෑමට ලක් නොවීය (රූපය 2A සහ රූපය S2A). . ප්‍රෝටියොමික්ස් ප්‍රතිඵලවලට අනුකූලව, මස්තිෂ්ක පටක කොටස්වල ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව PN හි සංකීර්ණ IV හි MTCO1 (මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් සයිටොක්‍රෝම් C ඔක්සිඩේස් උප ඒකකය 1) උප ඒකක මට්ටම ක්‍රමයෙන් අඩු වූ බව පෙන්නුම් කළේය (රූපය 2B). mtDNA-කේතනය කරන ලද උප ඒකකය Mtatp8 සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය (රූපය S2A), න්‍යෂ්ටික-කේතනය කරන ලද ATP සින්තේස් උප ඒකකයේ ස්ථාවර-තත්ව මට්ටම නොවෙනස්ව පැවතුනි, එය mtDNA ප්‍රකාශනය ස්ථායී වන විට දන්නා ස්ථායී ATP සින්තේස් උප එකලස් කිරීමේ F1 සංකීර්ණයට අනුකූල වේ. ගොඩනැගීම අනුකූල වේ. බාධා කරන්න (7). තත්‍ය කාලීන පොලිමරේස් දාම ප්‍රතික්‍රියාව (qPCR) මගින් වර්ග කරන ලද Mfn2cKO PN වල mtDNA මට්ටම ඇගයීමෙන් mtDNA පිටපත් අංකයේ ක්‍රමයෙන් අඩුවීම තහවුරු විය. පාලන කණ්ඩායම හා සසඳන විට, සති 8 දී, mtDNA මට්ටමෙන් 20% ක් පමණ පමණක් රඳවා ගන්නා ලදී (රූපය 2C). මෙම ප්‍රතිඵලවලට අනුකූලව, DNA හඳුනා ගැනීම සඳහා Mfn2cKO PN වල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂීය පැල්ලම් භාවිතා කරන ලද අතර, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් නියුක්ලියෝටයිඩවල කාලය මත යැපෙන පරිභෝජනය පෙන්නුම් කරයි (රූපය 2D). මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ප්‍රෝටීන් හායනය සහ ආතති ප්‍රතිචාරයට සම්බන්ධ සමහර අපේක්ෂකයින් පමණක් ඉහළ නියාමනය කර ඇති බව අපට පෙනී ගියේය, Lonp1, Afg3l2 සහ Clpx සහ OXPHOS සංකීර්ණ එකලස් කිරීමේ සාධක ඇතුළුව. ඇපොප්ටෝසිස් වලට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන මට්ටම්වල සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය නොවීය (රූපය S2B). ඒ හා සමානව, කැල්සියම් ප්‍රවාහනයට සම්බන්ධ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා සහ එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් නාලිකා වල සුළු වෙනස්කම් පමණක් ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය S2C). ඊට අමතරව, ස්වයංක්‍රීය භක්ෂක ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන ඇගයීමේදී සැලකිය යුතු වෙනස්කම් කිසිවක් හමු නොවූ අතර, එය ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව සහ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂය මගින් සජීවීව නිරීක්ෂණය කරන ලද ස්වයංක්‍රීය භක්ෂකසෝමවල දෘශ්‍ය ප්‍රේරණයට අනුකූල වේ (රූපය S3). කෙසේ වෙතත්, PN වල ප්‍රගතිශීලී OXPHOS අක්‍රියතාව පැහැදිලි අල්ට්‍රාස්ට්‍රක්චරල් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් වෙනස්කම් සමඟ ඇත. සති 5 සහ 8 වයසැති Mfn2cKO PN වල සෛල ශරීර සහ ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ගස්වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පොකුරු දැකිය හැකි අතර, අභ්‍යන්තර පටල ව්‍යුහය ගැඹුරු වෙනස්කම් වලට භාජනය වී ඇත (රූපය S4, A සහ ​​B). මෙම අල්ට්‍රාස්ට්‍රක්චරල් වෙනස්කම් සහ mtDNA හි සැලකිය යුතු අඩුවීමක් සමඟ අනුකූලව, ටෙට්‍රාමෙතිල්රොඩමයින් මෙතිල් එස්ටරය (TMRM) සමඟ උග්‍ර මස්තිෂ්ක මස්තිෂ්ක පෙති විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ Mfn2cKO PN වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පටල විභවය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇති බවයි (රූපය S4C).
(A) OXPHOS සංකීර්ණයේ ප්‍රකාශන මට්ටමේ කාල පාඨමාලා විශ්ලේෂණය. සති 8 දී P<0.05 සහිත ප්‍රෝටීන පමණක් සලකා බලන්න (ද්වි-මාර්ග ANOVA). තිත් රේඛාව: CTRL හා සසඳන විට ගැලපීමක් නොමැත. (B) වමේ: MTCO1 විරෝධී ප්‍රතිදේහයකින් ලේබල් කරන ලද මස්තිෂ්ක කොටසක උදාහරණයක් (පරිමාණ තීරුව, 20 μm). පර්කින්ජේ සෛල සිරුරු විසින් අල්ලා ගන්නා ලද ප්‍රදේශය කහ පැහැයෙන් ආවරණය කර ඇත. දකුණ: MTCO1 මට්ටම් ප්‍රමාණනය කිරීම (විචලනය පිළිබඳ එක්-මාර්ග විශ්ලේෂණය; n = මීයන් තිදෙනෙකුගෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලද සෛල 7 සිට 20 දක්වා). (C) වර්ග කළ PN හි mtDNA පිටපත් අංකයේ qPCR විශ්ලේෂණය (විචලනය පිළිබඳ එක්-මාර්ග විශ්ලේෂණය; n = මීයන් 3 සිට 7 දක්වා). (D) වමේ: ප්‍රති-DNA ප්‍රතිදේහයකින් ලේබල් කරන ලද මස්තිෂ්ක පෙත්තක උදාහරණයක් (පරිමාණ තීරුව, 20 μm). පර්කින්ජේ සෛල සිරුරු විසින් අල්ලා ගන්නා ලද ප්‍රදේශය කහ පැහැයෙන් ආවරණය කර ඇත. දකුණ: mtDNA තුවාල ප්‍රමාණනය කිරීම (විචලනය පිළිබඳ ඒකපාර්ශ්වික විශ්ලේෂණය; n = මීයන් තිදෙනෙකුගෙන් සෛල 5 සිට 9 දක්වා). (E) සම්පූර්ණ සෛල පැච් කලම්ප පටිගත කිරීමක mitoYFP + Purkinje සෛල (ඊතලය) පෙන්වන උග්‍ර මස්තිෂ්ක කොටසක උදාහරණයක්. (F) IV වක්‍රය ප්‍රමාණනය කිරීම. (G) CTRL සහ Mfn2cKO Purkinje සෛලවල විධ්‍රැවීකරණ ධාරා එන්නත් කිරීමේ නියෝජිත පටිගත කිරීම්. ඉහළ හෝඩුවාව: AP අවුලුවාලූ පළමු ස්පන්දනය. පහළ හෝඩුවාව: උපරිම AP සංඛ්‍යාතය. (H) පශ්චාත් සිනැප්ටික් ස්වයංසිද්ධ යෙදවුම් (sPSPs) ප්‍රමාණනය කිරීම. නියෝජිත පටිගත කිරීමේ හෝඩුවාව සහ එහි විශාලන අනුපාතය (I) හි දක්වා ඇත. මීයන් තිදෙනෙකුගෙන් n = 5 සිට 20 දක්වා සෛල විශ්ලේෂණය කරන ලද විචලනය පිළිබඳ ඒකපාර්ශ්වික විශ්ලේෂණය. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SEM ලෙස ප්‍රකාශ වේ; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) සිදුරු සහිත පැච් කලම්ප මාදිලිය භාවිතයෙන් වාර්තා කරන ලද ස්වයංසිද්ධ AP හි නියෝජිත සලකුණු. ඉහළ හෝඩුවාව: උපරිම AP සංඛ්‍යාතය. පහළ හෝඩුවාව: තනි AP හි විශාලනය. (K) (J) ට අනුව සාමාන්‍ය සහ උපරිම AP සංඛ්‍යාතය ප්‍රමාණනය කරන්න. මෑන්-විට්නි පරීක්ෂණය; n = 5 සෛල මීයන් හතර දෙනෙකුගෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SEM ලෙස ප්‍රකාශ වේ; වැදගත් නොවේ.
සති 8 ක් වයසැති Mfn2cKO PN හි පැහැදිලි OXPHOS හානියක් අනාවරණය වූ අතර, එයින් පෙන්නුම් කළේ නියුරෝන වල භෞතික විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වය දැඩි ලෙස අසාමාන්‍ය බවයි. එබැවින්, අපි සති 4 සිට 5 දක්වා සහ සති 7 සිට 8 දක්වා කාලය තුළ OXPHOS- ඌනතා නියුරෝන වල නිෂ්ක්‍රීය විද්‍යුත් ලක්ෂණ උග්‍ර මස්තිෂ්ක පෙති වල සම්පූර්ණ සෛල පැච් කලම්ප පටිගත කිරීම් සිදු කිරීමෙන් විශ්ලේෂණය කළෙමු (රූපය 2E). අනපේක්ෂිත ලෙස, Mfn2cKO නියුරෝන වල සාමාන්‍ය විවේක පටල විභවය සහ ආදාන ප්‍රතිරෝධය පාලනයට සමාන විය, නමුත් සෛල අතර සියුම් වෙනස්කම් තිබුණි (වගුව 1). ඒ හා සමානව, සති 4 සිට 5 දක්වා වයසේදී, වත්මන්-වෝල්ටීයතා සම්බන්ධතාවයේ (IV වක්‍රය) සැලකිය යුතු වෙනස්කම් කිසිවක් හමු නොවීය (රූපය 2F). කෙසේ වෙතත්, සති 7 සිට 8 දක්වා වයසැති Mfn2cKO නියුරෝන IV රෙජිමේන්තුවෙන් (අධි ධ්‍රැවීකරණ පියවර) නොනැසී පැවතුනි, මෙම ප්‍රමාද අවධියේදී අධි ධ්‍රැවීකරණ විභවයට පැහැදිලි සංවේදීතාවයක් ඇති බව පෙන්නුම් කරයි. ඊට වෙනස්ව, Mfn2cKO නියුරෝන වල, පුනරාවර්තන ක්‍රියාකාරී විභවය (AP) විසර්ජන ඇති කරන වි ධ්‍රැවීකරණ ධාරා හොඳින් ඉවසා සිටින අතර, ඒවායේ සමස්ත විසර්ජන රටා සති 8 ක් පැරණි පාලන නියුරෝන වලට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවන බව පෙන්නුම් කරයි (වගුව 1 සහ රූපය 2G). ඒ හා සමානව, ස්වයංසිද්ධ පශ්චාත් සිනැප්ටික් ධාරා (sPSC) වල සංඛ්‍යාතය සහ විස්තාරය පාලන කණ්ඩායමේ ඒවාට සමාන වූ අතර, සිදුවීම් සංඛ්‍යාතය සති 4 සිට සති 5 දක්වා සති 7 සිට සති 8 දක්වා සමාන වැඩිවීමක් සමඟ වැඩි විය (රූපය 2, H සහ I). PN වල උපාගමික පරිණත වීමේ කාලය (25). සිදුරු සහිත PN පැච් වලින් පසුව සමාන ප්‍රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී. මෙම වින්‍යාසය සම්පූර්ණ සෛල පැච් කලම්ප පටිගත කිරීමේදී සිදුවිය හැකි පරිදි, සෛලීය ATP දෝෂ සඳහා වන්දි ගෙවීම වළක්වයි. විශේෂයෙන්, Mfn2cKO නියුරෝන වල විවේක පටල විභවය සහ ස්වයංසිද්ධ වෙඩි තැබීමේ සංඛ්‍යාතය බලපා නොමැත (රූපය 2, J සහ K). සාරාංශයක් ලෙස, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ පැහැදිලි OXPHOS අක්‍රියතාවයක් ඇති PN වලට අධි-සංඛ්‍යාත විසර්ජන රටා සමඟ හොඳින් කටයුතු කළ හැකි බවයි, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ සාමාන්‍ය විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක ප්‍රතිචාර පවත්වා ගැනීමට ඔවුන්ට ඉඩ සලසන වන්දි යාන්ත්‍රණයක් ඇති බවයි.
දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SEM ලෙස ප්‍රකාශ වේ (විචලතාව පිළිබඳ ඒක-මාර්ග විශ්ලේෂණය, හොල්ම්-සිඩැක්ගේ බහු සංසන්දන පරීක්ෂණය; *P<0.05). ඒකක අංකය වරහන් මඟින් දක්වා ඇත.
ප්‍රෝටියොමික්ස් දත්ත කට්ටලයේ (රූපය 1G) කිසියම් කාණ්ඩයකට දරුණු OXPHOS ඌනතාවයට ප්‍රතිරෝධය දැක්විය හැකි මාර්ග ඇතුළත් දැයි විමර්ශනය කිරීමට අපි කටයුතු කළෙමු, එමඟින් බලපෑමට ලක් වූ PN සාමාන්‍ය විද්‍යුත් භෞතවේදය පවත්වා ගත හැක්කේ මන්දැයි පැහැදිලි කරයි (රූපය 2, E සිට K දක්වා). . ප්‍රෝටියොමික්ස් විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ ශාඛා දාම ඇමයිනෝ අම්ල (BCAA) කැටබොලිස්කරණයට සම්බන්ධ එන්සයිම සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවා ඇති බවයි (රූපය 3A සහ රූපය S5A), සහ අවසාන නිෂ්පාදනය ඇසිටිල්-CoA (CoA) හෝ සුචිනයිල් CoA ධමනි සිහින් අම්ල (TCA) චක්‍රයේ ට්‍රයිකාබොක්සිලේට් වලට අතිරේක විය හැකිය. BCAA ට්‍රාන්ස්ඇමිනේස් 1 (BCAT1) සහ BCAT2 යන දෙකෙහිම අන්තර්ගතය වැඩි වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය. ඔවුන් α-කීටොග්ලුටරේට් (26) වලින් ග්ලූටමේට් ජනනය කිරීමෙන් BCAA කැටබොලිස්වාදයේ පළමු පියවර උත්ප්‍රේරණය කරයි. ශාඛා දාම කීටෝ අම්ල ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් (BCKD) සංකීර්ණය සෑදෙන සියලුම උප ඒකක ඉහළ නියාමනයකට ලක් කර ඇත (සංකීර්ණය ප්‍රතිඵලයක් ලෙස BCAA කාබන් ඇටසැකිල්ලේ පසුකාලීන සහ ආපසු හැරවිය නොහැකි ඩිකාබොක්සිලේෂණය උත්ප්‍රේරණය කරයි) (රූපය 3A සහ රූපය S5A). කෙසේ වෙතත්, වර්ග කරන ලද PN හි BCAA හි කිසිදු පැහැදිලි වෙනසක් දක්නට නොලැබුණි, එය මෙම අත්‍යවශ්‍ය ඇමයිනෝ අම්ලවල සෛලීය අවශෝෂණය වැඩි වීම හෝ TCA චක්‍රයට අතිරේකව වෙනත් ප්‍රභවයන් (ග්ලූකෝස් හෝ ලැක්ටික් අම්ලය) භාවිතා කිරීම නිසා විය හැකිය (රූපය S5B). OXPHOS නොමැති PN වල සති 8 දී ග්ලූටමින් වියෝජනය සහ සම්ප්‍රේෂණ ක්‍රියාකාරකම් වැඩි වූ අතර, එය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් එන්සයිම ග්ලූටමිනේස් (GLS) සහ ග්ලූටමින් පයිරුවේට් ට්‍රාන්ස්ඇමිනේස් 2 (GPT2) ඉහළ නියාමනය මගින් පිළිබිඹු විය හැකිය (රූපය 3, A සහ ​​C). GLS හි ඉහළ යාම නියාමනය ස්ප්ලයිස් කරන ලද අයිසෝෆෝම් ග්ලූටමිනේස් C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL හි වෙනස ආසන්න වශයෙන් 4.5 ගුණයකින්, P = 0.05) ට සීමා වී ඇති බව සඳහන් කිරීම වටී, සහ පිළිකා පටක වල එහි නිශ්චිත ඉහළ යාම නියාමනය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෛව ශක්තියට සහාය විය හැකිය. (27).
(A) තාප සිතියම සති 8 දී නිශ්චිත මාර්ගය සඳහා ප්‍රෝටීන් මට්ටමේ නැමීමේ වෙනස පෙන්වයි. (B) ප්‍රති-PCx ප්‍රතිදේහ (පරිමාණ තීරුව, 20 μm) සමඟ ලේබල් කරන ලද මස්තිෂ්ක පෙත්තක උදාහරණය. කහ ඊතලය පර්කින්ජේ සෛල ශරීරය වෙත යොමු කරයි. (C) ධමනි සිහින් වීම සඳහා වැදගත් අපේක්ෂකයෙකු ලෙස හඳුනාගෙන ඇති කාල පාඨමාලා ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය (බහු t-පරීක්ෂණය, *FDR <5%; n = 3-5 මීයන්). (D) ඉහත: [1-13C]පයිරුවේට් ට්‍රේසරයේ අඩංගු ලේබල් කරන ලද කාබන් ඇතුළු කිරීමේ විවිධ ක්‍රම පෙන්වන ක්‍රමානුරූප රූප සටහනක් (එනම්, PDH හෝ ට්‍රාන්ස්-ධමනි මාර්ගය හරහා). පහළ: වයලීන ප්‍රස්ථාරයෙන් [1-13C]පයිරුවේට් (යුගල කළ t-පරීක්ෂණය; ** P <0.01) සමඟ උග්‍ර මස්තිෂ්ක පෙති ලේබල් කිරීමෙන් පසු ඇස්පාර්ටික් අම්ලය, සිට්‍රික් අම්ලය සහ මැලික් අම්ලය බවට පරිවර්තනය කරන ලද තනි ලේබල් කරන ලද කාබන් (M1) ප්‍රතිශතය පෙන්වයි. (E) දක්වා ඇති මාර්ගය පිළිබඳ පුළුල් කාල ඉතිහාස විශ්ලේෂණය. සති 8 දී P<0.05 සහිත ප්‍රෝටීන පමණක් සලකා බලන්න​. ඉරි සහිත රේඛාව: ගැලපුම් අගයක් නොමැත (විචලනය පිළිබඳ ද්වි-මාර්ග විශ්ලේෂණය; * P <0.05; *** P <0.001). දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SEM ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
අපගේ විශ්ලේෂණයේ දී, BCAA කැටබොලිස්වාදය ඉහළ-නියාමන මාර්ගවලින් එකක් බවට පත්ව ඇත. මෙම කරුණ තරයේ යෝජනා කරන්නේ OXPHOS නොමැති PN තුළ TCA චක්‍රයට ඇතුළු වන වාතාශ්‍රය පරිමාව වෙනස් විය හැකි බවයි. මෙය ස්නායු පරිවෘත්තීය නැවත රැහැන් ඇදීමක ප්‍රධාන ආකාරයක් නියෝජනය කළ හැකි අතර, එය දරුණු OXPHOS අක්‍රියතාව පවත්වා ගැනීමේදී ස්නායු කායික විද්‍යාව සහ පැවැත්මට සෘජු බලපෑමක් ඇති කළ හැකිය. මෙම කල්පිතයට අනුකූලව, ප්‍රධාන ප්‍රති-ධමනි සිහින් එන්සයිමය PCx ඉහළ-නියාමනය කර ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (Mfn2cKO/CTRL ආසන්න වශයෙන් 1.5 ගුණයකින් වෙනස් වේ; රූපය 3A), එය පයිරුවේට් ඔක්සලෝඇසිටේට් බවට පරිවර්තනය කිරීම උත්ප්‍රේරණය කරයි (28), එය මොළයේ පටක වල ඇතැයි විශ්වාස කෙරේ. ප්‍රකාශනය තාරකා සෛල වලට සීමා වේ (29, 30). ප්‍රෝටියොමික්ස් ප්‍රතිඵලවලට අනුකූලව, කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය පෙන්නුම් කළේ PCx ප්‍රකාශනය OXPHOS-අඩු PN වල විශේෂයෙන් සහ සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වී ඇති අතර PCx ප්‍රතික්‍රියාශීලීත්වය ප්‍රධාන වශයෙන් පාලනයේ යාබද බර්ග්මන් ග්ලියල් සෛල වලට සීමා වී ඇති බවයි (රූපය 3B). PCx හි නිරීක්ෂණය කරන ලද ඉහළ නියාමනය ක්‍රියාකාරීව පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි උග්‍ර මස්තිෂ්ක පෙති [1-13C] පයිරුවේට් ට්‍රේසරය සමඟ ප්‍රතිකාර කළෙමු. පයිරුවේට් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් (PDH) මගින් පයිරුවේට් ඔක්සිකරණය කළ විට, එහි සමස්ථානික ලේබලය අතුරුදහන් විය, නමුත් සනාල ප්‍රතික්‍රියා මගින් පයිරුවේට් පරිවෘත්තීය වන විට TCA චක්‍ර අතරමැදි වලට ඇතුළත් වේ (රූපය 3D). අපගේ ප්‍රෝටියොමික්ස් දත්ත වලට සහය දක්වමින්, Mfn2cKO පෙති වල ඇස්පාර්ටික් අම්ලයේ මෙම ට්‍රේසරයෙන් සලකුණු විශාල සංඛ්‍යාවක් අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර සිට්‍රික් අම්ලය සහ මැලික් අම්ලය ද මධ්‍යස්ථ ප්‍රවණතාවක් ඇති නමුත් සැලකිය යුතු නොවේ (රූපය 3D).
මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පිටපත් කිරීමේ සාධකය A ජානය (Tfam) විශේෂයෙන් විනාශ කරන ඩොපමයින් නියුරෝන නිසා ඇතිවන මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවය සහිත මයිටෝපාර්ක් මීයන්ගේ ඩොපමයින් නියුරෝන වල (රූපය S6B), PCx ප්‍රකාශනය ද සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලදී (31), ඇසිටෝන් අම්ල ධමනි සිහින් වීම ශරීරයේ ස්නායු OXPHOS අක්‍රියතාවය අතරතුර රෝගය ඇතිවීම නියාමනය වන බව පෙන්නුම් කරයි. ධමනි සිහින් වීම සමඟ සම්බන්ධ විය හැකි නියුරෝන වල ප්‍රකාශ විය හැකි අද්විතීය එන්සයිම (32-34) ප්‍රොපියොනයිල්-CoA කාබොක්සිලේස් (PCC-A) වැනි OXPHOS නොමැති PN වල සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන බව සොයාගෙන ඇති බව සඳහන් කිරීම වටී, මැලෝනයිල්-CoA ප්‍රොපියොනයිල්-CoA සුචිනයිල්-CoA බවට පරිවර්තනය කරයි සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් මැලික් එන්සයිම 3 (ME3), එහි ප්‍රධාන කාර්යභාරය වන්නේ මැලේට් වලින් පයිරුවේට් නැවත ලබා ගැනීමයි (රූපය 3, A සහ ​​C) (33, 35). ඊට අමතරව, Pdk3 එන්සයිමයේ සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් අපට හමු වූ අතර එය පොස්පරීකරණය කර PDH අක්‍රිය කරයි (36), PDH සක්‍රිය කරන Pdp1 එන්සයිමයේ හෝ PDH එන්සයිම සංකීර්ණයේම කිසිදු වෙනසක් අනාවරණය නොවීය (රූපය 3A). අඛණ්ඩව, Mern2cKO PN වල, Ser293 හි PDH සංකීර්ණයේ පයිරුවේට් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් E1 සංරචකයේ α1 උප ඒකකය α (PDHE1α) උප ඒකකයේ පොස්පරීකරණය වැඩි දියුණු කරන ලදී (රූපය S6C) (රූපය S6C). පයිරුවේට් වලට සනාල ප්‍රවේශයක් නොමැත.
අවසාන වශයෙන්, සක්‍රිය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, සෙරීන් සහ ග්ලයිසීන් ජෛව සංස්ලේෂණයේ සුපිරි මාර්ගය, අදාළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ෆෝලේට් (1C) චක්‍රය සහ ප්‍රෝලීන් ජෛව සංස්ලේෂණය (රූපය 1G සහ රූපය S5C) යන සියල්ලම සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නියාමනය කර ඇති බව අපට පෙනී ගියේය. අවට පටක මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයෙන් සක්‍රිය වේ (5-7). මෙම ප්‍රෝටියොමික්ස් දත්ත සඳහා සහාය වන කොන්ෆෝකල් විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ OXPHOS නොමැති PN හි, සති 8 ක් වයසැති මීයන්ගේ මස්තිෂ්ක පෙති, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ෆෝලේට් චක්‍රයේ ප්‍රධාන එන්සයිමයක් වන සෙරීන් හයිඩ්‍රොක්සිමීතයිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස් 2 (SHMT2) වලට භාජනය කර ඇති බවයි. සැලකිය යුතු ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරයක් (රූපය S5D). CU-ග්ලූකෝස්-ඉන්කියුබේටඩ් උග්‍ර මස්තිෂ්ක පෙති 13 කදී, පරිවෘත්තීය ලුහුබැඳීමේ අත්හදා බැලීම් මගින් සෙරීන් සහ ප්‍රෝලීන් ජෛව සංස්ලේෂණය ඉහළ නියාමනය තවදුරටත් තහවුරු කරන ලද අතර, කාබන් අයිසොෆෝම් සෙරීන් සහ ප්‍රෝලීන් බවට ප්‍රවාහය වැඩි වූ බව පෙන්නුම් කරයි (රූපය S5E). GLS සහ GPT2 මගින් ප්‍රවර්ධනය කරන ලද ප්‍රතික්‍රියා ග්ලූටමින් වලින් ග්ලූටමේට් සංස්ලේෂණය සහ ග්ලූටමේට් සහ α-කීටොග්ලුටරේට් අතර සම්ප්‍රේෂණය සඳහා වගකිව යුතු බැවින්, ඒවායේ ඉහළ නියාමනය පෙන්නුම් කරන්නේ OXPHOS- ඌනතා ස්නායු වලට ග්ලූටමේට් සඳහා වැඩි ඉල්ලුමක් ඇති බවයි, මෙය ප්‍රෝලීන් වල වැඩි ජෛව සංස්ලේෂණය පවත්වා ගැනීම අරමුණු කර ගත හැකිය (රූපය S5C). මෙම වෙනස්කම් වලට ප්‍රතිවිරුද්ධව, PN-විශේෂිත Mfn2cKO මීයන්ගෙන් මස්තිෂ්ක තාරකා සෛලවල ප්‍රෝටෝමික් විශ්ලේෂණයකින් පෙන්නුම් කළේ මෙම මාර්ග (සියලුම ප්‍රති-පෙරොක්සයිඩ් ඇතුළුව) ප්‍රකාශනයේ සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවූ බවයි, එබැවින් මෙම පරිවෘත්තීය හරවා යැවීම පිරිහුණු PN වෙත තෝරා ගන්නා බවයි (රූපය S6, D සිට G දක්වා).
සාරාංශයක් ලෙස, මෙම විශ්ලේෂණයන් මගින් PN වල නිශ්චිත පරිවෘත්තීය මාර්ගවල තාවකාලික සක්‍රිය කිරීමේ සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් රටා අනාවරණය විය. අසාමාන්‍ය ස්නායු මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ක්‍රියාකාරිත්වය මුල් කාලීන ධමනි සිහින් වීම සහ 1C ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමට (රූපය 3E සහ රූපය S5C) හේතු විය හැකි අතර, I සහ IV සංකීර්ණවල ප්‍රකාශනයේ පුරෝකථනය කළ හැකි වෙනස්කම් පවා ඇති කළ හැකි වුවද, සෙරීන් ඩි නවෝ සංස්ලේෂණයේ වෙනස්කම් එය ප්‍රමාද වූ අවධීන්හිදී පමණක් පැහැදිලි විය. OXPHOS අක්‍රියතාව (රූපය 3E සහ රූපය S5C). මෙම සොයාගැනීම් මගින් ආතතියෙන් ඇතිවන මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් (1C චක්‍රය) සහ සයිටොප්ලාස්මික් (සෙරීන් ජෛව සංස්ලේෂණය) ස්නායු පරිවෘත්තීය නැවත හැඩගැස්වීම සඳහා TCA චක්‍රයේ ධමනි සිහින් වීම වැඩිවීම සමඟ සහජීවනයෙන් ප්‍රතිචාර දක්වන අනුක්‍රමික ක්‍රියාවලියක් නිර්වචනය කරයි.
සති 8ක් වයසැති OXPHOS-ඌනතාවයෙන් පෙළෙන PN වලට අධි-සංඛ්‍යාත උද්දීපන ක්‍රියාකාරිත්වය පවත්වා ගත හැකි අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයට වන්දි ගෙවීම සඳහා සැලකිය යුතු පරිවෘත්තීය නැවත සම්බන්ධ වීමකට භාජනය විය හැකිය. මෙම සොයාගැනීම මේ මොහොතේ පවා, මෙම සෛල ස්නායු පරිහානිය ප්‍රමාද කිරීමට හෝ වැළැක්වීමට චිකිත්සක මැදිහත්වීමක් ලබා ගත හැකි බවට සිත්ගන්නා හැකියාවක් මතු කරයි. ප්‍රමාදයි. අපි ස්වාධීන මැදිහත්වීම් දෙකක් හරහා මෙම හැකියාව විසඳා ගත්තෙමු. පළමු ක්‍රමයේදී, අපි Cre-යැපෙන ඇඩිනෝ-ආශ්‍රිත වෛරස් (AAV) දෛශිකයක් නිර්මාණය කළෙමු, එවිට MFN2 OXPHOS-ඌනතාවයෙන් පෙළෙන PN වල වරණාත්මකව ප්‍රකාශ කළ හැකිය (රූපය S7A). AAV කේතනය කරන MFN2 සහ ප්‍රතිදීප්ත වාර්තාකරු ජානය mCherry (Mfn2-AAV) ප්‍රාථමික නියුරෝන සංස්කෘතීන් තුළ විට්‍රෝ තුළ සත්‍යාපනය කරන ලද අතර, එමඟින් MFN2 Cre-යැපෙන ආකාරයකින් ප්‍රකාශ කිරීමට හේතු වූ අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් රූප විද්‍යාව බේරා ගත් අතර එමඟින් Mfn2cKO නියුරෝන වල ස්නායු විකෘති වීම වළක්වයි (රූපය S7, B, D සහ E). ඊළඟට, අපි සති 8ක් වයසැති Mfn2-AAV Mfn2cKO හි මස්තිෂ්ක බාහිකයට ඒකාකෘතිකව ලබා දීමට සහ මීයන් පාලනය කිරීමට in vivo අත්හදා බැලීම් සිදු කළ අතර, සති 12ක් වයසැති මීයන් විශ්ලේෂණය කළෙමු (රූපය 4A). ප්‍රතිකාර කරන ලද Mfn2cKO මීයන් මිය ගියේය (රූපය 1, A සහ ​​B) (16). වෛරස් in vivo සම්ප්‍රේෂණය හේතුවෙන් සමහර මස්තිෂ්ක කවයන් තුළ PN හි තෝරාගත් ප්‍රකාශනය ඇති විය (රූපය S7, G සහ H). mCherry (Ctrl-AAV) පමණක් ප්‍රකාශ කරන පාලන AAV එන්නත් කිරීම Mfn2cKO සතුන්ගේ ස්නායු පරිහානියේ මට්ටමට සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කළේ නැත. ඊට වෙනස්ව, Mfn2-AAV සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද Mfn2cKO විශ්ලේෂණයෙන් PN සෛල ස්ථරයේ සැලකිය යුතු ආරක්ෂිත බලපෑමක් පෙන්නුම් කරන ලදී (රූපය 4, B සහ C). විශේෂයෙන්, නියුරෝන ඝනත්වය පාලන සතුන්ගෙන් වෙන් කොට හඳුනාගත නොහැකි බව පෙනේ (රූපය 4, B සහ C, සහ රූපය S7, H සහ I). MFN1 ප්‍රකාශනය MFN2 නොවන නමුත් ස්නායු මරණය සුරැකීමේදී සමානව ඵලදායී වේ (රූපය 4C සහ රූපය S7, C සහ F), එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ ectopic MFN1 ප්‍රකාශනය MFN2 හි ඌනතාවයට ඵලදායී ලෙස අතිරේක විය හැකි බවයි. තනි PN මට්ටමේ වැඩිදුර විශ්ලේෂණයකින් පෙන්නුම් කළේ Mfn2-AAV බොහෝ දුරට මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ අල්ට්‍රා ව්‍යුහය ගලවා ගත් බවත්, mtDNA මට්ටම් සාමාන්‍යකරණය කළ බවත්, ප්‍රති-ඇන්ජියෝජෙනසිස් සලකුණ PCx හි ඉහළ ප්‍රකාශනය ආපසු හැරවූ බවත්ය (රූපය 4, C සිට E දක්වා). විවේක තත්වයකදී බේරාගත් Mfn2cKO මීයන්ගේ දෘශ්‍ය පරීක්ෂාවෙන් පෙන්නුම් කළේ ඔවුන්ගේ ඉරියව් සහ මෝටර් රෝග ලක්ෂණ (චලනය S1 සිට S3 දක්වා) වැඩිදියුණු වී ඇති බවයි. අවසාන වශයෙන්, මෙම අත්හදා බැලීම්වලින් පෙනී යන්නේ OXPHOS හි දැඩි ඌනතාවයෙන් පෙළෙන PN වලට MFN2 ප්‍රමාද වී නැවත හඳුන්වා දීම mtDNA පරිභෝජනය ආපසු හැරවීමට සහ ධමනි සිහින් වීම ඇති කිරීමට ප්‍රමාණවත් බවත්, එමඟින් ඇක්සෝන් පරිහානිය සහ ස්නායු මරණය වැළැක්වීමට ප්‍රමාණවත් බවත්, එමඟින් vivo තුළ අක්ෂ පරිහානිය සහ ස්නායු මරණය වැළැක්වීමයි.
(A) දක්වා ඇති පරිවෘත්තීය මාර්ගය සක්‍රිය වූ විට AAV කේතනය කරන MFN2 එන්නත් කිරීම සඳහා වන පර්යේෂණාත්මක කාලසටහන පෙන්වන යෝජනා ක්‍රමයක්. (B) Mfn2cKO මීයන් තුළ සති 8 දී සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද සහ කැල්බින්ඩින් විරෝධී ප්‍රතිදේහයෙන් ලේබල් කරන ලද සති 12 ක් වයසැති මස්තිෂ්ක පෙති වල නියෝජිත කොන්ෆෝකල් රූප. දකුණ: ඇක්සෝන් තන්තු පරිමාණය කිරීම. ඇක්සෝන් විශාලනයේ පරිමාණය 450 සහ 75 μm වේ. (C) වමේ: AAV සම්ප්‍රේෂණ ලූපයේ (AAV+) පර්කින්ජේ සෛල ඝනත්වය ප්‍රමාණනය කිරීම (විචලනය පිළිබඳ ඒකපාර්ශ්වික විශ්ලේෂණය; n = මීයන් 3). දකුණ: 12 වන සතියේ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද PN හි mtDNA නාභිගත විශ්ලේෂණය (යුගල නොකළ t-පරීක්ෂණය; n = මීයන් තුනකින් සෛල 6). * P <0.05; ** P <0.01. (D) දක්වා ඇති වෛරස් දෛශික සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද Mfn2cKO මස්තිෂ්ක කොටස්වල PN වල නියෝජිත සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන ක්ෂුද්‍ර රූප. රෝස පැහැති ආවරණය ඩෙන්ඩ්‍රයිට් විසින් අල්ලාගෙන සිටින ප්‍රදේශය නිරූපණය කරන අතර, කහ පැහැති තිත් සහිත චතුරස්‍රය දකුණු පසින් සපයා ඇති විශාලනය නිරූපණය කරයි; n න්‍යෂ්ටිය නියෝජනය කරයි. පරිමාණ තීරුව, 1μm. (E) සති 12 දී සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද PN හි PCx පැල්ලම් කිරීමේ උදාහරණයක් පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව, 20μm. OE, අධික ප්‍රකාශනය; FC, නැමීමේ වෙනස.
අවසාන වශයෙන්, OXPHOS අක්‍රියතාවයට මුහුණ දුන් PN වල පෙරොක්සිඩේස්-ප්‍රේරිත සෛල පැවැත්මේ වැදගත්කම අපි විමර්ශනය කළෙමු. අපි විශේෂයෙන් මූසික PCx mRNA (AAV-shPCx) ඉලක්ක කර ගනිමින් mCherry කේතීකරණ AAV-shRNA (කෙටි කෙස් කටු RNA) ජනනය කළ අතර, වෛරසය හෝ එහි ස්ක්‍රැම්බල් පාලනය (AAV-scr) Mfn2cKO මීයන්ගේ මස්තිෂ්කයට එන්නත් කළෙමු. PCx ප්‍රකාශනය වැඩි වූ (රූපය 3C) සහ PN සෛල ස්ථරය තවමත් නොවෙනස්ව පැවති (රූපය 1A) කාල පරිච්ඡේදය තුළ ඵලදායී PCx knockdown ලබා ගැනීම සඳහා එන්නත වයසේ සිව්වන සතියේදී සිදු කරන ලදී (රූපය 5A). PCx (රූපය S8A) තට්ටු කිරීම PN මරණයේ සැලකිය යුතු ත්වරණයකට තුඩු දෙන බව සඳහන් කිරීම වටී, එය ආසාදිත වළල්ලට සීමා වේ (රූපය 5, B සහ C). PCx ඉහළ යාම මගින් ඇතිවන පරිවෘත්තීය බලපෑම්වල යාන්ත්‍රණය තේරුම් ගැනීම සඳහා, ග්ලූටතයෝන් ඇගයීම සඳහා PCx නොක්ඩවුන් සහ AAV-මැදිහත් වූ දෘශ්‍ය ජෛව සංවේදක Grx1-roGFP2 එකවර ප්‍රකාශ කිරීමෙන් පසු PN වල රෙඩොක්ස් තත්ත්වය අපි අධ්‍යයනය කළෙමු (රූපය S8, B සිට D දක්වා). පෙප්ටයිඩ රෙඩොක්ස් විභවයේ සාපේක්ෂ වෙනස (38). ඉන්පසුව, FLIM තත්වයන් සත්‍යාපනය කිරීමෙන් පසු සයිටොප්ලාස්මික් රෙඩොක්ස් තත්වයේ විභව වෙනස්කම් හඳුනා ගැනීම සඳහා සති 7 ක් වයසැති Mfn2cKO හෝ පාලන කසළ සගයන්ගේ උග්‍ර මොළයේ පෙති වල ද්වි-ෆෝටෝන ප්‍රතිදීප්ත ජීවිත කාලය පුරාම රූපකරණ අන්වීක්ෂය (FLIM) අපි සිදු කළෙමු (රූපය S8, E සිට G දක්වා). විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ PCx ප්‍රකාශනයක් නොමැති තනි Mfn2cKO PN වල ඔක්සිකරණ තත්වයේ සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කළ අතර එය ස්ක්‍රැම්බල් shRNA පමණක් ප්‍රකාශ කරන Mfn2cKO PN වලට වඩා වෙනස් වේ (රූපය 5, D සහ E). PCx ප්‍රකාශනය පහළට නියාමනය කළ විට, අධික ලෙස ඔක්සිකරණය වූ තත්වයක් පෙන්නුම් කරන Mfn2cKO PN වල ප්‍රතිශතය තුන් ගුණයකට වඩා වැඩි විය (රූපය 5E), PCx ඉහළ නියාමනය පිරිහුණු ස්නායු වල රෙඩොක්ස් ධාරිතාව පවත්වා ගෙන යන බව පෙන්නුම් කරයි.
(A) දක්වා ඇති පරිවෘත්තීය මාර්ගය සක්‍රිය වූ විට AAV කේතනය කරන shPCx එන්නත් කිරීම සඳහා වන පර්යේෂණාත්මක කාලසටහන පෙන්වන යෝජනා ක්‍රමයක්. (B) සති 4 දී ප්‍රති-කැල්සිනියුරින් ප්‍රතිදේහයෙන් සම්ප්‍රේෂණය කර ලේබල් කරන ලද Mfn2cKO මීයන් තුළ සති 8 ක් වයසැති මස්තිෂ්ක කොටස්වල නියෝජිත කොන්ෆෝකල් ඡායාරූප. පරිමාණ තීරුව, 450μm. (C) AAV-සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද ලූපවල පර්කින්ජේ සෛල ඝනත්වය ප්‍රමාණනය කිරීම (විචලතාව පිළිබඳ එක්-මාර්ග විශ්ලේෂණය; n = මීයන් 3 සිට 4 දක්වා). දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SEM ලෙස ප්‍රකාශ වේ; ***P<0.001. (D) නිශ්චිත පර්යේෂණාත්මක තත්වයන් යටතේ ග්ලූටතයෝන් රෙඩොක්ස් සංවේදකය Grx1-roGFP2 ප්‍රකාශ කරන සති 7 ක් වයසැති PN හි සාමාන්‍ය ආයු කාලය නියෝජිත FLIM පින්තූරය පෙන්වයි. LUT (බලන්න වගුව) අනුපාතය: පැවැත්මේ කාල පරතරය (පිකෝ තත්පර වලින්). පරිමාණ තීරුව, 25μm. (E) හිස්ටෝග්‍රෑම් එකෙහි (D) (n=158 සිට සෛල 368 දක්වා) සිට මීයන් දෙදෙනෙකු තුළ Grx1-roGFP2 ආයුකාල අගයන් බෙදා හැරීම පෙන්වයි. එක් එක් හිස්ටෝග්‍රෑම් එකට ඉහළින් ඇති පයි ප්‍රස්ථාරය: CTRL-AAV-scr හි සාමාන්‍ය ආයුකාල අගයෙන් SD 1 ඉක්මවන සැලකිය යුතු ලෙස දිගු (රතු, ඔක්සිකරණය වූ) හෝ කෙටි (නිල්, අඩු කළ) ආයුකාල අගයන් සහිත සෛල ගණන පෙන්වයි. (F) යෝජිත ආකෘතිය ස්නායු PCx ඉහළ නැංවීමේ ආරක්ෂිත බලපෑම පෙන්වයි.
සමස්තයක් වශයෙන්, අප මෙහි සපයන දත්තවලින් පෙනී යන්නේ MFN2 නැවත ප්‍රකාශනය මගින් දරුණු OXPHOS ඌනතාවය, දරුණු mtDNA ක්ෂය වීම සහ අතිශයින් අසාමාන්‍ය ista-සමාන රූප විද්‍යාව සහිත දියුණු PN සම්පූර්ණයෙන්ම ගලවා ගත හැකි බවත්, එමඟින් දියුණු රෝග වලදී පවා අඛණ්ඩ ප්‍රගතියක් ලබා දෙන බවත්ය. ස්නායු පරිහානිය සෛල මරණයට පෙර අවධිය පිළිබඳ ආපසු හැරවිය හැකි සාක්ෂි සපයයි. මෙම පරිවෘත්තීය නම්‍යශීලීභාවයේ මට්ටම තවදුරටත් අවධාරණය කරනු ලබන්නේ ධමනි සිහින් වීම (TCA චක්‍රයේ නැවත රැහැන් ඇදීම) ඇති කිරීමට නියුරෝන වලට ඇති හැකියාවෙනි, එය OXPHOS නොමැති PN වල PCx ප්‍රකාශනය වළක්වන අතර සෛල මරණය වැඩි දියුණු කරයි, එමඟින් ආරක්ෂිත කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි (රූපය 5F).
මෙම අධ්‍යයනයේ දී, OXPHOS අක්‍රියතාවයට PN වල ප්‍රතිචාරය, පරිවෘත්තීය වැඩසටහන් මගින් සක්‍රිය කරන ලද අවකල සක්‍රීය කිරීමේ මාර්ගය හරහා ක්‍රමයෙන් TCA චක්‍ර ධමනි සිහින් වීම වෙත අභිසාරී වීම බවට අපි සාක්ෂි ලබා දුන්නෙමු. බොහෝ අනුපූරක ක්‍රම සමඟ අපි ප්‍රෝටියෝමික් විශ්ලේෂණය තහවුරු කළ අතර දැඩි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයෙන් අභියෝගයට ලක් වූ විට, නියුරෝන කලින් නොදන්නා පරිවෘත්තීය ප්‍රත්‍යාස්ථතාවයක් ඇති බව හෙළි කළෙමු. අපගේ පුදුමයට කරුණක් නම්, සමස්ත නැවත රැහැන්ගත කිරීමේ ක්‍රියාවලිය ක්‍රමයෙන් සහ ආපසු හැරවිය නොහැකි ලෙස ස්නායු පරිහානිය සමඟ ඇති පර්යන්ත පරිවෘත්තීය තත්වය සලකුණු නොකරයි, නමුත් අපගේ දත්ත යෝජනා කරන්නේ එය සෛල මරණයට පෙර අවධියේදී පවා නඩත්තු නියුරෝනයක් සෑදිය හැකි බවයි. ක්‍රියාකාරී වන්දි යාන්ත්‍රණය. මෙම සොයාගැනීමෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ ස්නායු සෛල ශරීරයේ සැලකිය යුතු ප්‍රමාණයක පරිවෘත්තීය ප්ලාස්ටික් බවක් ඇති බවයි. මෙම කරුණ සනාථ කරන්නේ MFN2 පසුකාලීනව නැවත හඳුන්වාදීමෙන් ප්‍රධාන පරිවෘත්තීය සලකුණු ප්‍රකාශනය ආපසු හැරවිය හැකි අතර PN පරිහානිය වළක්වා ගත හැකි බවයි. ඊට පටහැනිව, එය ධමනි සිහින් වීම වළක්වන අතර ස්නායු වේගවත් කරයි. සංක්‍රාන්ති ලිංගික.
අපගේ පර්යේෂණයේ වඩාත්ම සිත් ඇදගන්නා සුළු සොයාගැනීම්වලින් එකක් නම්, OXPHOS නොමැති PN වලට ධමනි සිහින් වීම විශේෂයෙන් උත්තේජනය කරන එන්සයිම ඉහළ නැංවීම මගින් TCA චක්‍ර පරිවෘත්තීය වෙනස් කළ හැකි බවයි. පරිවෘත්තීය ප්‍රතිසංවිධානය පිළිකා සෛලවල පොදු ලක්ෂණයක් වන අතර, ඒවායින් සමහරක් TCA චක්‍ර අතරමැදි අතිරේකව අඩු කිරීමේ සමානකම් නිපදවීමට ග්ලූටමින් මත රඳා පවතින අතර ඒවා ශ්වසන දාමය ධාවනය කරන අතර ලිපිඩ සහ නියුක්ලියෝටයිඩ ජෛව සංස්ලේෂණ පූර්වගාමීන් නිෂ්පාදනය පවත්වා ගනී (39, 40). මෑත කාලීන අධ්‍යයනයකින් පෙන්නුම් කළේ OXPHOS අක්‍රියතාවය අත්විඳින පර්යන්ත පටක වල, ග්ලූටමින්/ග්ලූටමේට් පරිවෘත්තීය නැවත සම්බන්ධ කිරීම ද කැපී පෙනෙන ලක්ෂණයක් බවයි (5, 41), එහිදී TCA චක්‍රයට ග්ලූටමින් ඇතුළු වීමේ දිශාව රඳා පවතින්නේ OXPHOS තුවාලයේ බරපතලකම නිසාය (41). කෙසේ වෙතත්, ශරීරයේ ස්නායු පරිවෘත්තීය ප්ලාස්ටික් බවේ සමානකමක් සහ රෝග සන්දර්භය තුළ එහි ඇති විය හැකි අදාළත්වය පිළිබඳ පැහැදිලි සාක්ෂි නොමැත. මෑත කාලීන ඉන් විට්‍රෝ අධ්‍යයනයකදී, ප්‍රාථමික බාහික ස්නායු ස්නායු සම්ප්‍රේෂණය සඳහා ග්ලූටමේට් තටාක බලමුලු ගැන්වීමට පෙන්වන ලද අතර එමඟින් පරිවෘත්තීය ආතති තත්වයන් යටතේ ඔක්සිකාරක පරිවෘත්තීය හා ධමනි සිහින් වීම ප්‍රවර්ධනය කරයි (42). TCA චක්‍ර එන්සයිම සුචිනේට් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් හි ඖෂධීය නිෂේධනය යටතේ, පයිරුවේට් කාබොක්සිලේෂන් මගින් වගා කරන ලද මස්තිෂ්ක කැටිති නියුරෝන වල ඔක්සලෝඇසිටේට් සංස්ලේෂණය පවත්වා ගැනීමට හැකි බව විශ්වාස කෙරේ (34). කෙසේ වෙතත්, මොළයේ පටක සඳහා මෙම යාන්ත්‍රණවල භෞතික විද්‍යාත්මක අදාළත්වය (ධමනි සිහින් වීම ප්‍රධාන වශයෙන් තාරකා සෛල වලට සීමා වී ඇති බව විශ්වාස කෙරේ) තවමත් වැදගත් භෞතික විද්‍යාත්මක වැදගත්කමක් ඇත (43). මෙම අවස්ථාවේ දී, අපගේ දත්ත පෙන්වා දෙන්නේ ශරීරයේ OXPHOS මගින් හානි වූ PNs, TCA සංචිත අතරමැදි අතිරේකයේ ප්‍රධාන ප්‍රභවයන් දෙක වන BCAA හායනය සහ පයිරුවේට් කාබොක්සිලේෂන් වෙත මාරු කළ හැකි බවයි. ස්නායු සම්ප්‍රේෂණය සඳහා ග්ලූටමේට් සහ GABA හි භූමිකාවට අමතරව (44), මෙම යාන්ත්‍රණ සඳහා තවමත් සජීවීව කිසිදු සාක්ෂියක් නොමැත. එබැවින්, අක්‍රිය PNs ස්වයංක්‍රීයව ධමනි සිහින් වීම වැඩි කිරීමෙන් උකහා ගැනීමේ ක්‍රියාවලිය මගින් මෙහෙයවනු ලබන TCA අතරමැදි පරිභෝජනය සඳහා වන්දි ලබා දිය හැකි බව අනුමාන කිරීම පහසුය. විශේෂයෙන්, ඇස්පාර්ටික් අම්ලය සඳහා වැඩි ඉල්ලුමක් පවත්වා ගැනීම සඳහා PCx ඉහළ නැංවීම අවශ්‍ය විය හැකිය, එය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයෙන් පෙළෙන සෛල ප්‍රගුණනය කිරීමේදී යෝජනා කෙරේ (45). කෙසේ වෙතත්, අපගේ පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය Mfn2cKO PN වල ඇස්පාර්ටික් අම්ලයේ ස්ථාවර මට්ටමේ කිසිදු සැලකිය යුතු වෙනසක් හෙළි නොකළේය (රූපය S6A), එය අනුමාන වශයෙන් ප්‍රගුණනය වන සෛල සහ පශ්චාත්-මයිටොටික් නියුරෝන අතර ඇස්පාර්ටික් අම්ලයේ විවිධ පරිවෘත්තීය භාවිතය පිළිබිඹු කරයි. විවෝ හි අක්‍රිය නියුරෝන වල PCx ඉහළ නැංවීමේ නිශ්චිත යාන්ත්‍රණය තවමත් සංලක්ෂිත කළ යුතු වුවද, මෙම නොමේරූ ප්‍රතිචාරය නියුරෝන වල රෙඩොක්ස් තත්ත්වය පවත්වා ගැනීම සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව අපි පෙන්නුම් කළෙමු, එය මස්තිෂ්ක පෙති පිළිබඳ FLIM අත්හදා බැලීම් වලදී පෙන්නුම් කරන ලදී. විශේෂයෙන්, PCx ඉහළ නැංවීමෙන් PN වැළැක්වීම වඩාත් ඔක්සිකරණය වූ තත්වයකට හේතු විය හැකි අතර සෛල මරණය වේගවත් කළ හැකිය. BCAA පිරිහීම සක්‍රිය කිරීම සහ පයිරුවේට් කාබොක්සිලේෂණය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයේ පර්යන්ත පටක සංලක්ෂිත කිරීමේ ක්‍රම නොවේ (7). එමනිසා, ඒවා ස්නායු පරිහානිය සඳහා වැදගත් වන එකම ලක්ෂණය නොවුනත්, OXPHOS- ඌනතා ස්නායු වල ප්‍රමුඛතා ලක්ෂණයක් ලෙස පෙනේ.
මස්තිෂ්ක රෝගය යනු විෂමජාතීය ස්නායු පරිහානීය රෝගයක් වන අතර එය සාමාන්‍යයෙන් ඇටැක්සියාව ලෙස ප්‍රකාශ වන අතර බොහෝ විට PN වලට හානි කරයි (46). මෙම නියුරෝන ජනගහනය විශේෂයෙන් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයට ගොදුරු වේ, මන්ද මීයන් තුළ ඔවුන්ගේ තෝරාගත් පරිහානිය මිනිස් ස්පිනෝසෙරෙබෙලර් ඇටැක්සියාව සංලක්ෂිත කරන බොහෝ මෝටර් රෝග ලක්ෂණ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීමට ප්‍රමාණවත් වේ (16, 47, 48). වාර්තාවලට අනුව, විකෘති ජානයක් සහිත සංක්‍රාන්ති මී ආකෘතියක් මානව ස්පයිනෝසෙරෙබෙලර් ඇටැක්සියාව සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයක් ඇත (49, 50), PNPH හි OXPHOS ඌනතාවයේ ප්‍රතිවිපාක අධ්‍යයනය කිරීමේ වැදගත්කම අවධාරණය කරයි. එබැවින්, මෙම අද්විතීය නියුරෝන ජනගහනය ඵලදායී ලෙස හුදකලා කර අධ්‍යයනය කිරීම විශේෂයෙන් සුදුසු වේ. කෙසේ වෙතත්, PN පීඩනයට ඉතා සංවේදී වන අතර සමස්ත මස්තිෂ්ක සෛල ජනගහනයෙන් අඩු ප්‍රතිශතයක් සඳහා වගකිව යුතු බැවින්, බොහෝ ඕමික්ස් මත පදනම් වූ අධ්‍යයනයන් සඳහා, ඒවා සම්පූර්ණ සෛල ලෙස වරණාත්මකව වෙන් කිරීම තවමත් අභියෝගාත්මක අංගයකි. අනෙකුත් සෛල වර්ගවල (විශේෂයෙන් වැඩිහිටි පටක) දූෂණයෙන් තොර වීම සම්පූර්ණයෙන්ම සාක්ෂාත් කර ගැනීම පාහේ කළ නොහැක්කක් වුවද, පහළ ප්‍රෝටියෝමික්ස් විශ්ලේෂණය සඳහා ප්‍රමාණවත් ශක්‍ය නියුරෝන සංඛ්‍යාවක් ලබා ගැනීම සඳහා අපි FACS සමඟ ඵලදායී විඝටන පියවරක් ඒකාබද්ධ කළ අතර, මුළු මස්තිෂ්කයේම පවතින දත්ත කට්ටලය හා සසඳන විට තරමක් ඉහළ ප්‍රෝටීන් ආවරණයක් (ප්‍රෝටීන 3000 ක් පමණ) ඇත (51). සම්පූර්ණ සෛලවල ශක්‍යතාව ආරක්ෂා කිරීමෙන්, අප මෙහි සපයන ක්‍රමය මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ පරිවෘත්තීය මාර්ගවල වෙනස්කම් පරීක්ෂා කිරීමට පමණක් නොව, සෛල වර්ගය පොහොසත් කිරීම සඳහා මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් පටල ටැග් භාවිතය සම්පූර්ණ කරන එහි සයිටොප්ලාස්මික් සගයන්ගේ වෙනස්කම් පරීක්ෂා කිරීමට ද අපට ඉඩ සලසයි. සංකීර්ණ පටක වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ගණන සඳහා නව ක්‍රමය (52, 53). අප විස්තර කරන ක්‍රමය පර්කින්ජේ සෛල අධ්‍යයනයට පමණක් සම්බන්ධ නොවන අතර, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයේ අනෙකුත් ආකෘති ඇතුළුව රෝගී මොළයේ පරිවෘත්තීය වෙනස්කම් ආමන්ත්‍රණය කිරීම සඳහා ඕනෑම වර්ගයක සෛලයකට පහසුවෙන් යෙදිය හැකිය.
අවසාන වශයෙන්, මෙම පරිවෘත්තීය ප්‍රතිසංවිධාන ක්‍රියාවලියේදී සෛලීය ආතතියේ ප්‍රධාන සලකුණු සම්පූර්ණයෙන්ම ආපසු හැරවිය හැකි සහ ස්නායු පරිහානිය වළක්වා ගත හැකි චිකිත්සක කවුළුවක් අපි හඳුනාගෙන ඇත්තෙමු. එබැවින්, මෙහි විස්තර කර ඇති නැවත රැහැන් ඇදීමෙහි ක්‍රියාකාරී ඇඟවුම් අවබෝධ කර ගැනීමෙන් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයේදී ස්නායු ශක්‍යතාව පවත්වා ගැනීම සඳහා කළ හැකි ප්‍රතිකාර පිළිබඳ මූලික අවබෝධයක් ලබා දිය හැකිය. අනෙකුත් මොළයේ සෛල වර්ගවල ශක්ති පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියේ වෙනස්කම් විච්ඡේදනය කිරීම අරමුණු කරගත් අනාගත පර්යේෂණ, මෙම මූලධර්මය අනෙකුත් ස්නායු රෝග සඳහා අදාළ වන ආකාරය සම්පූර්ණයෙන්ම හෙළි කිරීමට අවශ්‍ය වේ.
MitoPark මීයන් කලින් විස්තර කර ඇත (31). loxP පාර්ශ්වීය Mfn2 ජාන සහිත C57BL/6N මීයන් කලින් විස්තර කර ඇත (18) සහ L7-Cre මීයන් සමඟ හරස් කර ඇත (23). ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ද්විත්ව විෂමජාතීය පරම්පරාව පසුව සමජාතීය Mfn2loxP/Mfn2loxP මීයන් සමඟ හරස් කර Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) සඳහා පර්කින්ජේ-විශේෂිත ජාන තට්ටු කිරීම් ජනනය කරන ලදී. සංසර්ගයේ උප කාණ්ඩයක, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ඇලිලය (stop-mtYFP) අතිරේක හරස් මාර්ග හරහා හඳුන්වා දෙන ලදී (20). සියලුම සත්ව ක්‍රියා පටිපාටි යුරෝපීය, ජාතික සහ ආයතනික මාර්ගෝපදේශවලට අනුකූලව සිදු කරන ලද අතර ජර්මනියේ උතුරු රයින්-වෙස්ට්ෆාලියා හි උම්වෙල්ට් සහ වර්බ්‍රෞචර්ෂුට්ස් හි ලෑන්ඩෙසම්ට්ෆර්නැටූර් විසින් අනුමත කරන ලදී. සත්ව කටයුතු යුරෝපීය රසායනාගාර සත්ව විද්‍යා සංගම් සම්මේලනයේ මඟ පෙන්වීම ද අනුගමනය කරයි.
ගර්භනී කාන්තාවගේ ගැබ්ගෙල විස්ථාපනය නිර්වින්දනය කිරීමෙන් පසු, මී කළලය හුදකලා කරනු ලැබේ (E13). හැන්ක්ස්ගේ සමතුලිත ලුණු ද්‍රාවණය (HBSS) හි බාහිකය 10 mM හෙප්ස් සමඟ අතිරේකව විච්ඡේදනය කර පැපේන් (20 U/ml) සහ සිස්ටීන් (1μg/ml) අඩංගු ඩල්බෙකෝගේ නවීකරණය කරන ලද ඊගල් මාධ්‍යයට ලබා දෙන ලදී. DMEM හි පටක ඉන්කියුබේට් කර එන්සයිම ජීර්ණයෙන් එය විඝටනය කරන්න. Ml) 37°C දී මිනිත්තු 20 ක් සඳහා, පසුව භ්‍රෑණ ගව සෙරුමය 10% ක් සමඟ අතිරේකව DMEM හි යාන්ත්‍රිකව අඹරනු ලැබේ. සෛල සෙන්ටිමීටර 6 ක සංස්කෘතික කෑමකට 2×106 ඝනත්වයකින් හෝ රූප විශ්ලේෂණය සඳහා 0.5×105 සෛල/cm2 ඝනත්වයකින් පොලිලයිසීන් ආලේප කරන ලද වීදුරු ආවරණ මත බීජ කරන ලදී. පැය 4 කට පසු, මාධ්‍යය 1% B27 අතිරේකයක් සහ 0.5 mM GlutaMax අඩංගු ස්නායු බාසල් සෙරුමය-නිදහස් මාධ්‍යයකින් ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලදී. ඉන්පසු නියුරෝන අත්හදා බැලීම පුරාවට 37°C සහ 5% CO2 හි පවත්වා ගෙන ගිය අතර සතියකට වරක් පෝෂණය කරන ලදී. නැවත සංයෝජන ඇති කිරීම සඳහා, දෙවන දිනයේදී නියුරෝන වලට ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා පහත සඳහන් AAV9 වෛරස් දෛශිකයේ 3μl (24-ළිං සංස්කෘතික කෑමක්) හෝ 0.5μl (24-ළිං තහඩුව) භාවිතා කරන ලදී. in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, නාමාවලි අංකය 105530-AAV9) සහ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, නාමාවලි අංකය 105545-AAV9).
මූසික Mfn1 සහ Mfn2 අනුපූරක DNA (පිළිවෙලින් Addgene ප්ලාස්මිඩ් #23212 සහ #23213 වෙතින් ලබා ගන්නා ලදී) C-පර්යන්තයේ V5 අනුක්‍රමය (GKPIPNPLLGLDST) සමඟ සලකුණු කර ඇති අතර, T2A අනුක්‍රමය හරහා රාමුව තුළ mCherry සමඟ ඒකාබද්ධ වේ. Grx1-roGFP2 යනු හයිඩෙල්බර්ග් TP Dick DFKZ (ඩොයිෂ් ක්‍රෙබ්ස්ෆෝර්ෂ්චුන්සෙන්ට්‍රම්) වෙතින් ලැබුණු ත්‍යාගයකි. සාම්ප්‍රදායික ක්ලෝනකරණ ක්‍රම භාවිතා කරමින් tdTomato කැසට් පටය ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීමෙන්, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 සහ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 දෛශික ජනනය කිරීම සඳහා කැසට් පටය pAAV-CAG-FLEX-tdTomato කොඳු නාරටිය (Addgene reference number 28306) තුළට උපක්ලෝන කරන ලදී. pAAV-CAG-FLEX-mCherry පාලන දෛශිකය ජනනය කිරීම සඳහා සමාන උපාය මාර්ගයක් භාවිතා කරන ලදී. AAV-shPCx නිර්මාණය ජනනය කිරීම සඳහා, ප්ලාස්මිඩ් AAV දෛශිකයක් (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) අවශ්‍ය වන අතර, එහි shRNA ඉලක්ක කරගත් මූසික PCx කේතනය කරන DNA අනුපිළිවෙල අඩංගු වේ (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) U6 ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ, mCherry CMV ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ භාවිතා වේ. සහායක AAV දෛශික නිෂ්පාදනය නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් (Cell Biolabs) අනුව සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) රැගෙන යන හුවමාරු ප්ලාස්මිඩයක් තාවකාලිකව භාවිතා කරන්න. 293AAV සෛල-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) හෝ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) කේතන ජානය තාවකාලිකව මාරු කිරීම, මෙන්ම AAV1 කැප්සිඩ් ප්‍රෝටීන් සහ උපාංග ප්‍රෝටීන් කේතනය කිරීම. කැල්සියම් පොස්පේට් ක්‍රමය භාවිතා කරමින් ප්ලාස්මිඩ් ප්ලාස්මිඩ් ඇසුරුම් කිරීම. වියළි අයිස්/එතනෝල් ස්නානයක කැටි-දියවන චක්‍ර සහ පොස්පේට් බෆර් කළ සේලයින් (PBS) තුළ ලයිස් කරන ලද සෛල මගින් අමු වෛරස් සුපිරි ද්‍රව්‍ය ලබා ගන්නා ලදී. AAV දෛශිකය අඛණ්ඩ අයඩික්සනෝල් අනුක්‍රමික අල්ට්‍රා කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය (32,000 rpm සහ 4°C දී පැය 24) මගින් පිරිසිදු කරන ලද අතර Amicon අල්ට්‍රා-15 කේන්ද්‍රාපසාරී පෙරහනක් භාවිතයෙන් සාන්ද්‍රණය කරන ලදී. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ජෙනෝම පිටපත (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX හි ජෙනෝම ටයිටරය කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි විය (54), තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) සහ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) මගින් මනිනු ලැබේ.
ප්‍රාථමික නියුරෝන අයිස්-සීතල 1x PBS වලින් ඉවත් කර, පෙති කර, පසුව පොස්පේටේස් සහ ප්‍රෝටීස් නිෂේධකය (රෝචේ) අඩංගු 0.5% ට්‍රයිටන් X-100 / 0.5% සෝඩියම් ඩිඔක්සිචොලේට්/PBS ලිසිස් බෆරය තුළ සමජාතීය කරන ලදී. බයිසින්කොනිනික් අම්ල විශ්ලේෂණය (තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් ප්‍රමාණනය සිදු කරන ලදී. ඉන්පසු ප්‍රෝටීන SDS-පොලියැක්‍රිලමයිඩ් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් මගින් වෙන් කරන ලද අතර, පසුව පොලිවයිනයිලයිඩීන් ෆ්ලෝරයිඩ් පටලයක් (GE හෙල්ත්කෙයාර්) මත බ්ලොට් කරන ලදී. නිශ්චිත නොවන ස්ථාන අවහිර කර TBST (Tween සමඟ ට්‍රිස්-බෆර් කළ සේලයින්), සේදීමේ පියවර සහ TBST ඉන්කියුබේට් හි ද්විතියික ප්‍රතිදේහයේ 5% කිරි වල ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය (විස්තර සඳහා වගුව S1 බලන්න) සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන්න. +4°C දී එක රැයකින් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන්න. සේදීමෙන් පසු, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 2 ක් ද්විතියික ප්‍රතිදේහය යොදන්න. පසුව, ප්‍රති-β-ඇක්ටින් ප්‍රතිදේහයක් සමඟ එම බ්ලොට් එක ඉන්කියුබේට් කිරීමෙන්, එම පැටවීම තහවුරු කරන ලදී. රසායනික දීප්තිය බවට පරිවර්තනය කිරීම සහ රසායනික දීප්තිය වැඩි දියුණු කිරීම මගින් හඳුනා ගැනීම (GE සෞඛ්‍ය සේවා).
වීදුරු ආවරණ මත කලින් බීජ කරන ලද නියුරෝන කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 10 ක් සඳහා නිශ්චිත කාල ලක්ෂ්‍යයේදී 4% පැරෆෝමල්ඩිහයිඩ් (PFA)/PBS සමඟ සවි කරන ලදී. ආවරණ ස්ලිප් පළමුව කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 0.1% ට්‍රයිටන් X-100/PBS සමඟ විනිවිද යන අතර පසුව අවහිර කිරීමේ බෆරය තුළ [3% ගව සෙරුම් ඇල්බියුමින් (BSA)/PBS] ඇත. දෙවන දිනයේදී, ආවරණ ස්ලිප් අවහිර කිරීමේ බෆරයකින් සෝදා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 2 ක් සඳහා සුදුසු ෆ්ලෝරෝෆෝර්-සංයුක්ත ද්විතියික ප්‍රතිදේහය සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී; අවසාන වශයෙන්, සාම්පල PBS තුළ හොඳින් සෝදා 4′,6-ඩයමිඩිනෝ-2 -ෆීනයිලින්ඩෝල් (DAPI) සමඟ ප්‍රති-පැල්ලම් කර පසුව ඇක්වා-පොලි/මවුන්ට් සමඟ අන්වීක්ෂ ස්ලයිඩය මත සවි කර ඇත.
මීයන් (පිරිමි සහ ගැහැණු) කැටමයින් (130 mg/kg) සහ සයිලසීන් (10 mg/kg) අභ්‍යන්තර පෙරිටෝනියල් එන්නත් කිරීම මගින් නිර්වින්දනය කරන ලද අතර කාප්‍රොෆෙන් වේදනා නාශක (5 mg/kg) සමඟ චර්මාභ්‍යන්තරව පරිපාලනය කරන ලද අතර උණුසුම් පෑඩ් එකකින් සමන්විත ස්ටීරියෝටැක්ටික් උපකරණයක (Kopf) තබා ඇත. හිස් කබල නිරාවරණය කර දන්ත සරඹයක් භාවිතා කර මිස් අස්ථියට අනුරූප වන මස්තිෂ්ක බාහිකයේ කොටස තුනී කරන්න (ලැම්ඩා සිට: වලිගය 1.8, පාර්ශ්වීය 1, ලෝබියුල්ස් IV සහ V වලට අනුරූප වේ). පහළ සනාල පද්ධතියට බාධා නොකිරීමට හිස් කබලේ කුඩා සිදුරක් ප්‍රවේශමෙන් නිර්මාණය කිරීමට වක්‍ර සිරින්ජ ඉඳිකටුවක් භාවිතා කරන්න. ඉන්පසු සිහින් ඇද ගන්නා ලද වීදුරු කේශනාලිකා ක්ෂුද්‍ර කුහරයට සෙමින් ඇතුල් කරනු ලැබේ (ඩුරා මැටරයේ උදර පැත්තේ -1.3 සිට -1 දක්වා), සහ 200 සිට 300 nl AAV ක්ෂුද්‍ර ඉන්ජෙක්ටරයට (නරිෂිගේ) අතින් සිරින්ජ (නරිෂිගේ) සමඟ මිනිත්තු 10 සිට 20 දක්වා කාලයක් තුළ අඩු පීඩනයකින් කිහිප වතාවක් එන්නත් කරනු ලැබේ. මුදල් සම්භාරයක් වියදම් කිරීමෙන් පසු, වෛරසය සම්පූර්ණයෙන්ම පැතිරීමට ඉඩ දීම සඳහා කේශනාලිකා තවත් විනාඩි 10 ක් තබන්න. කේශනාලිකා ඉවත් කළ පසු, තුවාලයේ දැවිල්ල අවම කර සත්වයාට සුවය ලැබීමට සම ප්‍රවේශමෙන් මැහුම් කරනු ලැබේ. සැත්කමෙන් පසු දින කිහිපයක් සතුන්ට වේදනා නාශක (කැස්පොෆෙන්) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර, එම කාලය තුළ ඔවුන්ගේ ශාරීරික තත්ත්වය හොඳින් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර පසුව ප්‍රකාශිත වේලාවේදී ඔවුන් අනායාසයට ලක් කරන ලදී. සියලුම ක්‍රියා පටිපාටි යුරෝපීය, ජාතික සහ ආයතනික මාර්ගෝපදේශවලට අනුකූලව සිදු කරන ලද අතර ජර්මනියේ උතුරු රයින්-වෙස්ට්ෆාලියා හි උම්වෙල්ට් සහ වර්බ්‍රෞචර්ෂුට්ස් හි ලෑන්ඩෙසම්ට්ෆර්නාටූර් විසින් අනුමත කරන ලදී.
සතුන්ට කෙටමයින් (100 mg/kg) සහ සයිලසීන් (10 mg/kg) සමඟ නිර්වින්දනය කරන ලද අතර, හදවත මුලින්ම 0.1 M PBS සමඟ සහ පසුව PBS හි 4% PFA සමඟ පර්ෆියුස් කරන ලදී. පටක විච්ඡේදනය කර 4% PFA/PBS හි එක රැයකින් 4°C දී සවි කරන ලදී. PBS හි ස්ථාවර මොළයෙන් සැජිටල් කොටස් (50 μm ඝනකම) සකස් කිරීම සඳහා කම්පන පිහියක් (ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම්ස් GmbH, වියානා, ඔස්ට්‍රියාව) භාවිතා කරන ලදී. වෙනත් ආකාරයකින් නිශ්චිතව දක්වා නොමැති නම්, ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි (13) කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සහ කලවම් කිරීමේදී නිදහස්-පාවෙන කොටස් පැල්ලම් කිරීම සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, පළමුව, ලබාගත් පෙති කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 15 ක් සඳහා 0.5% ට්‍රයිටන් X-100/PBS සමඟ පාරගම්ය කරන ලදී; සමහර එපිටෝප් සඳහා (Pcx සහ Shmt2), 80°C (PH 9) හි ට්‍රයිස්-EDTA බෆරයෙන් පෙති විනාඩි 25 ක් රත් කරන්න. ඊළඟට, කොටස් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය සමඟ (වගුව S1 බලන්න) අවහිර කිරීමේ බෆරයේ (3% BSA/PBS) 4°C දී එක රැයකින් කලවම් කරමින් ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. ඊළඟ දවසේ, කොටස් අවහිර කිරීමේ බෆරයෙන් සෝදා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සුදුසු ෆ්ලෝරෝෆෝර්-සංයුක්ත ද්විතියික ප්‍රතිදේහය සමඟ පැය 2 ක් ඉන්කියුබේට් කරන ලදී; අවසානයේදී, කොටස් PBS තුළ හොඳින් සෝදා, DAPI සමඟ ප්‍රති-පැල්ලම් කර, පසුව අන්වීක්ෂීය ස්ලයිඩයක AquaPolymount සමඟ සවි කරන ලදී.
සුදු ආලෝක ලේසර් සහ 405 ඩයෝඩ පාරජම්බුල ලේසර් වලින් සමන්විත ලේසර් ස්කෑනිං කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂයක් (TCS SP8-X හෝ TCS ඩිජිටල් ලයිට් ෂීට්, ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම්ස්) සාම්පලය රූපගත කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. ෆ්ලෝරෝෆෝරය උද්දීපනය කිරීමෙන් සහ හයිබ්‍රිඩ් ඩිටෙක්ටර් (HyDs) සමඟ සංඥාව එකතු කිරීමෙන්, අනුක්‍රමික ආකාරයෙන් නයික්විස්ට් සාම්පලයට අනුකූල වන ගොඩගැසූ රූප එකතු කිරීම සඳහා LAS-X මෘදුකාංගය භාවිතා කරන ලදී: ප්‍රමාණාත්මක නොවන පැනල් සඳහා, එය ඉතා ගතික සංඥා වේ (උදාහරණයක් ලෙස, සොමාටික් සෛල සහ ඩෙන්ඩ්‍රයිට් වල) mtYFP) BrightR මාදිලියේ PN ගණන හඳුනා ගැනීමට HyD භාවිතා කරන්න). පසුබිම අඩු කිරීම සඳහා 0.3 සිට 6 ns දක්වා ගේට්ටුව යොදනු ලැබේ.
වර්ග කළ සෛලවල තත්‍ය කාලීන රූපකරණය. 1% B27 අතිරේකය සහ 0.5 mM GlutaMax අඩංගු Neurobasal-A මාධ්‍යයෙන් වර්ග කිරීමෙන් පසු, සෛල වහාම පොලි-එල්-ලයිසීන්-ආලේපිත වීදුරු ස්ලයිඩ මත (μ-Slide8 Well, Ibidi, නාමාවලි අංකය 80826) බීජ කරන ලද අතර, පසුව සෛල පදිංචි වීමට ඉඩ දීම සඳහා එය පැය 1 ක් 37°C සහ 5% CO2 හි තබා ගන්න. සුදු ලේසර්, HyD, 63×[1.4 සංඛ්‍යාත්මක විවරය (NA)] තෙල් වෛෂයික කාචයකින් සහ තාපන වේදිකාවකින් සමන්විත Leica SP8 ලේසර් ස්කෑනිං කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂයක් මත තත්‍ය කාලීන රූපකරණය සිදු කරන ලදී.
මීයා ඉක්මනින් කාබන් ඩයොක්සයිඩ් සමඟ නිර්වින්දනය කර හිස ගසා දමන ලදී, මොළය ඉක්මනින් හිස් කබලෙන් ඉවත් කරන ලදී, සහ 200μm ඝනකම (13C ලේබල් කිරීමේ අත්හදා බැලීම සඳහා) හෝ 275μm ඝනකම (ෆෝටෝන අත්හදා බැලීම් දෙකක් සඳහා) සැජිටල් කොටසට කපා පහත සඳහන් ද්‍රව්‍ය වලින් පුරවා ඇත. අයිස්ක්‍රීම් (HM-650 V, තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්, වෝල්ඩෝෆ්, ජර්මනිය) පහත සඳහන් ද්‍රව්‍ය වලින් පුරවා ඇත: 125 mM අයිස්-සීතල, කාබන්-සංතෘප්ත (95% O2 සහ 5% CO2) අඩු Ca2 + කෘතිම මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලය (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, 25 mM NaHCO3, 25 mM ග්ලූකෝස්, 0.5 mM CaCl2 සහ 3.5 mM MgCl2 (310 සිට 330 mmol දක්වා ඔස්මොටික් පීඩනය). ලබාගත් මොළයේ පෙති ඉහළ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ග්ලූකෝස්, 1.0 mM CaCl2 සහ 2.0 mM MgCl2) මධ්‍යම) pH අගය 7.4 සහ 310 සිට 320 mmol) අඩංගු පූර්ව-ඉන්කියුබේෂන් කුටියකට මාරු කරන්න.
රූපකරණ ක්‍රියාවලිය අතරතුර, පෙති කැපවූ රූපකරණ කාමරයකට ගෙන යන ලද අතර, 32° සිට 33°C දක්වා නියත උෂ්ණත්වයකදී අඛණ්ඩ ACSF පර්ෆියුෂන් යටතේ අත්හදා බැලීම සිදු කරන ලදී. පෙති රූපකරණය සඳහා ලයිකා 25x වෛෂයික කාචයකින් (NA 0.95, ජලය), Ti: නිල් මැණික් ලේසර් (චමිලියන් විෂන් II, කොහෙරන්ට්) සමන්විත බහු ෆොටෝන ලේසර් ස්කෑනිං අන්වීක්ෂයක් (TCS SP8 MP-OPO, ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම්ස්) භාවිතා කරන ලදී. FLIM මොඩියුලය (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 හි FLIM. PN වල සයිටොප්ලාස්මික් රෙඩොක්ස් තත්වයේ වෙනස්කම් සැජිටල් මොළයේ පෙති වල ද්වි-ෆෝටෝන FLIM මගින් මනිනු ලැබූ අතර, එහිදී Grx1-roGFP2 ජෛව සංවේදකය PN ඉලක්ක කර ගත්තේය. PN ස්ථරයේ, අත්පත් කර ගැනීමේ ක්ෂේත්‍රය පෙති මතුපිටට පහළින් 50 සිට 80 μm පමණ දුරින් තෝරා ගනු ලබන්නේ ශක්‍ය PN එකක් (එනම්, පබළු ව්‍යුහයක් නොමැතිකම හෝ ඩෙන්ඩ්රයිට් දිගේ ස්නායු රූප විද්‍යාත්මක වෙනස්කම්) සහ ද්විත්ව ධනාත්මක roGFP2 සංවේදකය සහ AAV කේතනය කරන shRNA PCx හෝ එහි පාලන අනුපිළිවෙල (එක් එක් සම-ප්‍රකාශිත mCherry) ඇති බව සහතික කිරීම සඳහා ය. 2x ඩිජිටල් විශාලනය සහිත තනි-ස්ටැක් රූප එකතු කරන්න [උද්දීපන තරංග ආයාමය: 890 nm; 512 nm 512 පික්සල]. හඳුනාගැනීම: අභ්‍යන්තර HyD, ෆ්ලෝරෝසීන් අයිසොතියෝසයනේට් (FITC) පෙරහන් කණ්ඩායම] සහ මිනිත්තු 2 සිට 3 දක්වා සාමාන්‍ය රූපයක් භාවිතා කර වක්‍ර සවි කිරීම සඳහා ප්‍රමාණවත් ෆෝටෝන එකතු කිරීම (මුළු ෆෝටෝන 1000) සහතික කෙරේ. Grx1-roGFP2 පරීක්ෂණයේ සංවේදීතාව සහ FLIM තත්වයන් සත්‍යාපනය කිරීම සිදු කරන ලද්දේ පර්ෆියුෂන් ACSF වෙත බාහිර 10 mM H2O2 එකතු කරන විට roGFP2 හි ආයු කාලය නිරීක්ෂණය කිරීමෙනි (ඔක්සිකරණය උපරිම කිරීමට, ආයු කාලය වැඩි කිරීමට හේතු වේ), ඉන්පසු 2 mM ඩයිතියෝත්‍රයිටෝල් එකතු කිරීමෙනි (අඩු කිරීමේ මට්ටම අවම කරයි, ආයු කාලය අඩු කරයි) (රූපය S8, D සිට G දක්වා). ලබාගත් ප්‍රතිඵල විශ්ලේෂණය කිරීමට FLIMfit 5.1.1 මෘදුකාංගය භාවිතා කරන්න, සම්පූර්ණ රූපයේ තනි ඝාතීය ක්ෂය වීමේ වක්‍රය මනින ලද IRF (උපකරණ ප්‍රතිචාර ශ්‍රිතය) වෙත ගැළපෙන්න, සහ χ2 ආසන්න වශයෙන් 1 වේ. තනි PN එකක ආයු කාලය ගණනය කිරීම සඳහා, ස්නායු ශරීරය වටා ඇති ආවරණය අතින් අඳින ලද අතර, එක් එක් ආවරණයේ සාමාන්‍ය ආයු කාලය ප්‍රමාණනය සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විභව විශ්ලේෂණය. උග්‍ර කොටස පර්ෆියුස් කරන ලද ACSF වෙත මිනිත්තු 30ක් සෘජුවම එකතු කරන ලද 100 nM TMRM සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමෙන් පසුව, PN වල මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විභව වෙනස්කම් ද්වි-ෆෝටෝන අන්වීක්ෂයක් මගින් මනිනු ලැබීය. TMRM ප්‍රතිබිම්බනය සිදු කරන ලද්දේ 920 nm දී පරීක්ෂණය උත්තේජනය කර අභ්‍යන්තර HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) භාවිතා කරමින් සංඥා එකතු කිරීමෙනි; එකම උද්දීපන තරංග ආයාමය භාවිතා කරමින් නමුත් mtYFP ප්‍රතිබිම්බ කිරීමට වෙනස් අභ්‍යන්තර HyD (FITC :525/50) භාවිතා කිරීමෙනි. තනි සෛල මට්ටමින් මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් විභවය ඇගයීමට ImageJ හි රූප කැල්කියුලේටරය ප්ලග්-ඉන් භාවිතා කරන්න. කෙටියෙන් කිවහොත්, ප්ලග්-ඉන් සමීකරණය: සංඥාව = min (mtYFP, TMRM) අනුරූප නාලිකාවේ තනි-ස්ටැක් කොන්ෆෝකල් රූපයේ පර්කින්ජේ සෝමාලි හි TMRM සංඥාව පෙන්වන මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් කලාපය හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරයි. ඉන්පසු ලැබෙන ආවරණයේ ඇති පික්සල් ප්‍රදේශය ප්‍රමාණනය කර, මයිටොකොන්ඩ්‍රීය විභවය පෙන්වන මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් භාගය ලබා ගැනීම සඳහා mtYFP නාලිකාවේ අනුරූප එළිපත්ත තනි-ස්ටැක් රූපය මත සාමාන්‍යකරණය කරනු ලැබේ.
රූපය Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් විසංයෝජනය කරන ලදී. ටයිල්වල ස්කෑන් කරන ලද පින්තූර සඳහා, LAS-X මෘදුකාංගය මඟින් සපයන ලද ස්වයංක්‍රීය මැහුම් ඇල්ගොරිතමය භාවිතයෙන් තනි ටයිල් එකක මොන්ටේජ් එක සාදනු ලැබේ. රූප ක්‍රමාංකනයෙන් පසුව, රූපය තවදුරටත් සැකසීමට සහ දීප්තිය සහ වෙනස ඒකාකාරව සකස් කිරීමට ImageJ සහ Adobe Photoshop භාවිතා කරන්න. ග්‍රැෆික් සකස් කිරීම සඳහා Adobe Illustrator භාවිතා කරන්න.
mtDNA නාභිගත විශ්ලේෂණය. confocal අන්වීක්ෂය මගින් DNA වලට එරෙහිව ප්‍රතිදේහ සමඟ ලේබල් කරන ලද මස්තිෂ්ක කොටස් මත mtDNA තුවාල ගණන ප්‍රමාණනය කරන ලදී. සෑම ඉලක්ක ප්‍රදේශයක්ම සෛල ශරීරය සහ එක් එක් සෛලයේ න්‍යෂ්ටිය සඳහා නිර්මාණය කරන ලද අතර, අදාළ ප්‍රදේශය බහු මිනුම් ප්ලග්-ඉන් (ImageJ මෘදුකාංගය) භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී. සයිටොප්ලාස්මික් ප්‍රදේශය ලබා ගැනීම සඳහා සෛල ශරීර ප්‍රදේශයෙන් න්‍යෂ්ටික ප්‍රදේශය අඩු කරන්න. අවසාන වශයෙන්, එළිපත්ත රූපයේ mtDNA දැක්වෙන සයිටොප්ලාස්මික් DNA ලක්ෂ්‍ය ස්වයංක්‍රීයව ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා Analyze Particles ප්ලග්-ඉන් (ImageJ මෘදුකාංගය) භාවිතා කරන ලද අතර, ලබාගත් ප්‍රතිඵල CTRL මීයන්ගේ PN සාමාන්‍යයට සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී. ප්‍රතිඵල සෛලයකට සාමාන්‍ය නියුක්ලියෝසයිඩ් ගණන ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය. තනි සෛල මට්ටමින් PN හි ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය ඇගයීමට ImageJ හි රූප කැල්කියුලේටරය ප්ලග්-ඉන් භාවිතා කරන්න. කෙටියෙන් කිවහොත්, අනුරූප නාලිකාවේ තනි-ස්ථර confocal රූපයේ, සමීකරණය හරහා: සංඥාව = min (mtYFP, ප්‍රතිදේහ), පර්කිනා හි යම් ප්‍රතිදේහයකට ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය පෙන්වන මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් කලාපය හඳුනා ගැනේ. ඉන්පසු ලැබෙන ආවරණයේ ඇති පික්සල් ප්‍රදේශය ප්‍රමාණනය කර, පසුව ප්‍රදර්ශනය කරන ලද ප්‍රෝටීනයේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් කොටස ලබා ගැනීම සඳහා mtYFP නාලිකාවේ අනුරූප එළිපත්ත තනි-ස්ටැක් රූපය මත සාමාන්‍යකරණය කරනු ලැබේ.
පර්කින්ජේ සෛල ඝනත්ව විශ්ලේෂණය. ImageJ හි සෛල කවුන්ටරය ප්ලග්-ඉන් භාවිතා කර පර්කින්ජේ ඝනත්වය තක්සේරු කරන ලද්දේ ගණන් කරන ලද පර්කින්ජේ සෛල ගණන ගණන් කරන ලද සෛල විසින් අල්ලාගෙන සිටින මස්තිෂ්ක වළල්ලේ දිග අනුව බෙදීමෙනි.
සාම්පල සකස් කිරීම සහ එකතු කිරීම. පාලන කණ්ඩායමේ සහ Mfn2cKO මීයන්ගේ මොළය 0.1 M පොස්පේට් බෆරයේ (PB) 2% PFA/2.5% ග්ලූටරල්ඩිහයිඩ් තුළ සවි කරන ලද අතර, පසුව කිරීටක කොටස් සිලියට් (Leica Mikrosysteme GmbH, වියානා, ඔස්ට්‍රියාව) භාවිතයෙන් සකස් කරන ලදී (ඝනකම 50 සිට 60 μm දක්වා). ඉන්පසු PB බෆරයේ 1% os ටෙට්‍රොක්සයිඩ් සහ 1.5% පොටෑසියම් ෆෙරෝසයනයිඩ් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් සවි කරන ලදී. කොටස් ආසවනය කළ ජලයෙන් තුන් වරක් සෝදා, පසුව 1% යුරේනයිල් ඇසිටේට් අඩංගු 70% එතනෝල් සමඟ විනාඩි 20 ක් පැල්ලම් කරන ලදී. ඉන්පසු කොටස් ශ්‍රේණිගත කළ ඇල්කොහොල් වල විජලනය කර සිලිකන් ආලේපිත වීදුරු ස්ලයිඩ අතර ඩර්කුපන් ACM (Araldite වාත්තු දුම්මල M) ඉෙපොක්සි ෙරසින් (ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂ විද්‍යා, නාමාවලි අංකය 14040) තුළට කාවැද්දූ අතර අවසානයේ 60°C දී උඳුන තුල පැය 48 ක් පොලිමරයිස් කරන ලදී. මස්තිෂ්ක බාහික ප්‍රදේශය තෝරාගෙන ලයිකා අල්ට්‍රාකට් (ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම් ජීඑම්බීඑච්, වියානා, ඔස්ට්‍රියාව) මත 50 nm අල්ට්‍රාතින් කොටස් කපා පොලිස්ටිරීන් පටලයකින් ආලේප කරන ලද 2×1 මි.මී. තඹ ස්ලිට් ජාලයක් මත තෝරා ගන්නා ලදී. කොටස් H2O හි 4% යුරේනයිල් ඇසිටේට් ද්‍රාවණයකින් මිනිත්තු 10 ක් පැල්ලම් කර, H2O සමඟ කිහිප වතාවක් සෝදා, පසුව H2O හි රෙනෝල්ඩ්ස් ඊයම් සයිටේ්‍රට් සමඟ මිනිත්තු 10 ක් සෝදා, පසුව H2O සමඟ කිහිප වතාවක් සෝදා ඇත. TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 ඩිජිටල් කැමරාවක් (TVIPS GmbH, Gauting, USA) භාවිතා කරමින් සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂයක් වන Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) සමඟ ක්ෂුද්‍ර රූප ලබා ගන්නා ලදී. ජර්මනිය).
AAV ආසාදිත මීයන් සඳහා, මොළය වෙන් කර 1 mm ඝනකම සැජිටල් කොටසකට කපා, AAV-ආසාදිත වළල්ල (එනම්, mCherry ප්‍රකාශ කිරීම) හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් මස්තිෂ්කය පරීක්ෂා කරන ලදී. AAV එන්නත් කිරීම අවම වශයෙන් අඛණ්ඩ මස්තිෂ්ක වළලු දෙකක පර්කින්ජේ සෛල ස්ථරයේ (එනම් පාහේ සම්පූර්ණ ස්ථරය) ඉතා ඉහළ සම්ප්‍රේෂණ කාර්යක්ෂමතාවයක් ඇති කරන අත්හදා බැලීම් පමණක් භාවිතා වේ. AAV-සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද ලූපය එක රැයකින් පසු සවි කිරීම සඳහා ක්ෂුද්‍ර විච්ඡේදනය කරන ලදී (4% PFA සහ 0.1 M කොකෝට් බෆරයේ 2.5% ග්ලූටරල්ඩිහයිඩ්) සහ තවදුරටත් සකසන ලදී. EPON කාවැද්දීම සඳහා, ස්ථාවර පටක 0.1 M සෝඩියම් කොකෝට් බෆරයකින් (Applichem) සෝදා, 0.1 M සෝඩියම් කොකෝට් බෆරයකින් (Applichem) පැය 4 ක් 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී, පසුව පැය 2 ක් සේදීම. 0.1 M කොකාමයිඩ් බෆරයකින් 3 වතාවක් නැවත නැවත කරන්න. ඉන්පසුව, පටක විජලනය කිරීම සඳහා එතනෝල් ආරෝහණ ශ්‍රේණිය 4°C දී සෑම එතනෝල් ද්‍රාවණයක්ම මිනිත්තු 15ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. පටක ප්‍රොපිලීන් ඔක්සයිඩ් වෙත මාරු කර 4°C දී EPON (සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) හි එක රැයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී නැවුම් EPON හි පටක පැය 2ක් තබන්න, ඉන්පසු එය පැය 72ක් 62°C දී තැන්පත් කරන්න. අල්ට්‍රාමයික්‍රොටෝමයක් (ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම්ස්, UC6) සහ දියමන්ති පිහියක් (ඩයටෝම්, බියෙල්, ස්විට්සර්ලන්තය) භාවිතා කර 70 nm අල්ට්‍රා තුනී කොටස් කපා, 37°C දී විනාඩි 15ක් 1.5% යුරේනයිල් ඇසිටේට් සමඟ පැල්ලම් කර, ඊයම් සයිටේ්‍රට් ද්‍රාවණයකින් මිනිත්තු 4ක් පැල්ලම් කරන්න. ඉලෙක්ට්‍රෝන ක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆි කැමරා OneView 4K 16-bit (ගැටන්) සහ ඩිජිටල් මයික්‍රොග්‍රැෆ් මෘදුකාංග (ගැටන්) වලින් සමන්විත JEM-2100 Plus සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂයක් (JEOL) භාවිතයෙන් ලබා ගන්නා ලදී. විශ්ලේෂණය සඳහා, 5000× හෝ 10,000× ඩිජිටල් විශාලනය සමඟ ඉලෙක්ට්‍රෝන ක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆ් ලබා ගන්නා ලදී.
මයිටොකොන්ඩ්‍රියා හි රූප විද්‍යාත්මක විශ්ලේෂණය. සියලුම විශ්ලේෂණයන් සඳහා, ImageJ මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් ඩිජිටල් රූපවල තනි මයිටොකොන්ඩ්‍රියා හි සමෝච්ඡයන් අතින් දක්වා ඇත. විවිධ රූප විද්‍යාත්මක පරාමිතීන් විශ්ලේෂණය කරනු ලැබේ. මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ඝනත්වය ප්‍රකාශ වන්නේ එක් එක් සෛලයේ මුළු මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ප්‍රදේශය සයිටොප්ලාස්ම් ප්‍රදේශයෙන් (සයිටොප්ලාස්ම් ප්‍රදේශය = සෛල ප්‍රදේශය-සෛල න්‍යෂ්ටිය ප්‍රදේශය) × 100 මගින් බෙදීමෙන් ලබාගත් ප්‍රතිශතයක් ලෙස ය. මයිටොකොන්ඩ්‍රියා හි වටකුරු බව [4π (ප්‍රදේශය/පරිමිතිය 2)] සූත්‍රය සමඟ ගණනය කෙරේ. මයිටොකොන්ඩ්‍රියා හි ඉස්ටා රූප විද්‍යාව විශ්ලේෂණය කර ඒවායේ ප්‍රධාන හැඩයන් අනුව කාණ්ඩ දෙකකට (“නල” සහ “බිබිලි”) බෙදා ඇත.
ඔටෝෆාගෝසෝම/ලයිසොසෝම අංකය සහ ඝනත්ව විශ්ලේෂණය. ඩිජිටල් රූපයේ එක් එක් ඔටෝෆාගෝසෝමයේ/ලයිසොසෝමයේ සමෝච්ඡයන් අතින් ගෙනහැර දැක්වීමට ImageJ මෘදුකාංගය භාවිතා කරන්න. ඔටෝෆාගෝසෝම/ලයිසොසෝම ප්‍රදේශය ප්‍රකාශ කරනු ලබන්නේ එක් එක් සෛලයේ මුළු ඔටෝෆාගෝසෝම/ලයිසොසෝම ව්‍යුහ ප්‍රදේශය සයිටොප්ලාස්ම ප්‍රදේශයෙන් (සයිටොප්ලාස්ම ප්‍රදේශය=සෛල ප්‍රදේශය-න්‍යෂ්ටික ප්‍රදේශය)×100 බෙදීමෙන් ගණනය කරන ලද ප්‍රතිශතයක් ලෙසය. ඔටෝෆාගෝසෝම/ලයිසොසෝමවල ඝනත්වය ගණනය කරනු ලබන්නේ මුළු සංඛ්‍යාව සෛලයකට ඇති ඔටෝෆාගෝසෝම/ලයිසොසෝම ව්‍යුහ ගණනින් (සයිටොප්ලාස්මික් ප්‍රදේශය අනුව) බෙදීමෙනි (සයිටොප්ලාස්මික් ප්‍රදේශය = සෛල ප්‍රදේශය-න්‍යෂ්ටික ප්‍රදේශය).
උග්‍ර කොටස් කිරීම සහ සාම්පල සකස් කිරීම සඳහා ලේබල් කිරීම. ග්ලූකෝස් ලේබල් කිරීම අවශ්‍ය වන අත්හදා බැලීම් සඳහා, උග්‍ර මොළයේ පෙති පූර්ව-ඉන්කියුබේෂන් කුටියකට මාරු කරන්න, එහි සංතෘප්ත කාබන් (95% O2 සහ 5% CO2), ඉහළ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-ග්ලූකෝස්, 1.0 mM CaCl 2 සහ 2.0 mM MgCl 2, pH අගය 7.4 සහ 310 සිට 320 mOsm දක්වා සකස් කර ඇත), එහි ග්ලූකෝස් 13 C 6- ග්ලූකෝස් ආදේශනය (යුරිසොටොප්, නාමාවලි අංකය CLM-1396). පයිරුවේට් ලේබල් කිරීම අවශ්‍ය වන අත්හදා බැලීම් සඳහා, උග්‍ර මොළයේ පෙති ඉහළ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ග්ලූකෝස්, 1.0 mM CaCl2 සහ 2.0mM MgCl2 එකතු කරන්න, pH 7.4 සහ 310 සිට 320mOsm දක්වා සකසන්න), සහ 1mM 1-[1-13C] පයිරුවේට් (යුරිසොටොප්, නාමාවලි අංකය CLM-1082) එකතු කරන්න. 37°C දී කොටස් විනාඩි 90 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන්න. අත්හදා බැලීම අවසානයේ, කොටස් ඉක්මනින් 75 mM ඇමෝනියම් කාබනේට් අඩංගු ජලීය ද්‍රාවණයකින් (pH 7.4) සෝදා, පසුව 40:40:20 (v:v:v) ඇසිටොනයිට්‍රයිල් (ACN) හි සමජාතීයකරණය කරන ලදී: මෙතනෝල්: ජලය. කොටස් අයිස් මත මිනිත්තු 30ක් පුර්ව තැන්පත් කිරීමෙන් පසු, සාම්පල ග්‍රෑම් 21,000 ක උෂ්ණත්වයකදී විනාඩි 10 ක් 4°C දී කේන්ද්‍රාපසාරී කර, පැහැදිලි සුපිරි ද්‍රව්‍යය SpeedVac සාන්ද්‍රණයක වියළන ලදී. ප්‍රතිඵලයක් ලෙස වියළන ලද පරිවෘත්තීය පෙති විශ්ලේෂණය තෙක් -80°C දී ගබඩා කරන ලදී.
C-ලේබල් කරන ලද ඇමයිනෝ අම්ල 13 ක ද්‍රව වර්ණදේහ-ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂමිතික විශ්ලේෂණය. ද්‍රව වර්ණදේහ-ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂමිතික (LC-MS) විශ්ලේෂණය සඳහා, පරිවෘත්තීය පෙති LC-MS ශ්‍රේණියේ ජලයේ (Honeywell) 75μl හි නැවත රඳවා ගන්නා ලදී. 4°C දී මිනිත්තු 5 ක් සඳහා ග්‍රෑම් 21,000 ක කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමෙන් පසු, පැහැදිලි කරන ලද සුපිරි ද්‍රව්‍යයෙන් 20 μl ඇමයිනෝ අම්ල ප්‍රවාහ විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන ලද අතර, ඉතිරි සාරය වහාම ඇනායන විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන ලදී (පහත බලන්න). කලින් විස්තර කරන ලද බෙන්සොයිල් ක්ලෝරයිඩ් ව්‍යුත්පන්න කිරීමේ ප්‍රොටෝකෝලය භාවිතයෙන් ඇමයිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී (55, 56). පළමු පියවරේදී, පරිවෘත්තීය සාරය 20μl ට 100 mM සෝඩියම් කාබනේට් (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) 10μl එකතු කරන ලද අතර, පසුව 2% බෙන්සොයිල් ක්ලෝරයිඩ් (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) 10μl LC ශ්‍රේණියේ ACN වෙත එකතු කරන ලදී. නියැදිය කෙටියෙන් වෝටෙක්ස් කර, පසුව 20°C දී මිනිත්තු 5ක් ග්‍රෑම් 21,000 කින් කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. නිෂ්කාශනය කරන ලද සුපර්නේටන්ට් කේතුකාකාර වීදුරු ඇතුළු කිරීමක් (200 μl පරිමාව) සහිත 2 ml ස්වයංක්‍රීය සාම්පල්ලර් කුප්පියකට මාරු කරන්න. Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) අධි-විභේදන නිරවද්‍යතා ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (Thermo Fisher Scientific) හා ​​සම්බන්ධ Acquity iClass අතිශය ඉහළ කාර්ය සාධන LC පද්ධතිය (Waters) භාවිතයෙන් සාම්පල විශ්ලේෂණය කරන ලදී. විශ්ලේෂණය සඳහා, ව්‍යුත්පන්න කරන ලද නියැදියෙන් 2μl ක් 1.8μm අංශු අඩංගු 100×1.0 mm අධි-ශක්ති සිලිකා T3 තීරුවකට (Waters) එන්නත් කරන ලදී. ප්‍රවාහ අනුපාතය 100μl/min වන අතර, බෆර් පද්ධතිය බෆර් A (10 mM ඇමෝනියම් ෆෝමේට් සහ ජලයේ 0.15% ෆෝමික් අම්ලය) සහ බෆර් B (ACN) වලින් සමන්විත වේ. අනුක්‍රමණය පහත පරිදි වේ: මිනිත්තු 0 කදී 0%B; 0%B. මිනිත්තු 0 සිට 0.1 දක්වා 0 සිට 15% B දක්වා; මිනිත්තු 0.1 සිට 0.5 දක්වා 15 සිට 17% B දක්වා; මිනිත්තු 0.5 සිට 14 දක්වා 17 සිට 55% දක්වා B දක්වා; මිනිත්තු 14 සිට 14.5 දක්වා 55 සිට 70% දක්වා B දක්වා; මිනිත්තු 18 සිට 14.5 දක්වා 70 සිට 100% B දක්වා; මිනිත්තු 18 සිට 19 දක්වා 100% B දක්වා; මිනිත්තු 19 සිට 19.1 දක්වා 100 සිට 0% B දක්වා; මිනිත්තු 19.1 සිට 28 දක්වා 0% B දක්වා (55, 56). QE-HF ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය ධනාත්මක අයනීකරණ මාදිලියේ ක්‍රියාත්මක වන අතර ස්කන්ධ පරාසය m/z (ස්කන්ධ/ආරෝපණ අනුපාතය) 50 සිට 750 දක්වා වේ. යොදන ලද විභේදනය 60,000 වන අතර, ලබාගත් ලාභ පාලන (AGC) අයන ඉලක්කය 3×106 වන අතර උපරිම අයන කාලය මිලි තත්පර 100 කි. රත් වූ විද්‍යුත් ඉසින අයනීකරණ (ESI) ප්‍රභවය 3.5 kV ඉසින වෝල්ටීයතාවයකින්, 250°C කේශනාලිකා උෂ්ණත්වයකින්, 60 AU (අත්තනෝමතික ඒකක) කොපු වායු ප්‍රවාහයකින් සහ 20 AU සහායක වායු ප්‍රවාහයකින් ක්‍රියාත්මක වේ. 250°C. S කාචය 60 AU ලෙස සකසා ඇත.
13C ලේබල් කරන ලද කාබනික අම්ලවල ඇනායන වර්ණදේහ-MS විශ්ලේෂණය. ඉතිරි පරිවෘත්තීය අවක්ෂේපය (55μl) QE-HF ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයකට (තාප ෆිෂර් සයන්ටිෆික්) සම්බන්ධ කර ඇති ඩයෝනෙක්ස් අයන වර්ණදේහ පද්ධතියක් (ICS 5000+, තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, පරිවෘත්තීය සාරය 5μl 1 ක පිරවුම් අනුපාතයක් සහිත තල්ලු-ඉන් අර්ධ ලූප් මාදිලියේ HPLC (2 mm×250 mm, අංශු ප්‍රමාණය 4μm, තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්) වලින් සමන්විත ඩයෝනෙක්ස් අයන පැක් AS11-HC තීරුවකට එන්නත් කරන ලදී. ) ඩයෝනෙක්ස් අයන පැක් AG11-HC ආරක්ෂක තීරුව (2 mm x 50 mm, 4μm, තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්). තීරු උෂ්ණත්වය 30°C හි පවත්වා ගෙන යන අතර, ස්වයංක්‍රීය සාම්පලය 6°C ලෙස සකසා ඇත. ඉලුවෙන්ට් උත්පාදක යන්ත්‍රය හරහා පොටෑසියම් හයිඩ්‍රොක්සයිඩ් අනුක්‍රමණයක් ජනනය කිරීම සඳහා ඩයෝනීකරණය කළ ජලය සමඟ සපයා ඇති පොටෑසියම් හයිඩ්‍රොක්සයිඩ් කාට්රිජ් භාවිතා කරන්න. පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය 380μl/min ප්‍රවාහ අනුපාතයකින් වෙන් කිරීම, පහත සඳහන් අනුක්‍රමණය යොදමින්: 0 සිට 3 මිනිත්තු, 10 mM KOH; 3 සිට 12 මිනිත්තු, 10 සිට 50 mM KOH; 12 සිට 19 මිනිත්තු, 50 සිට 100 mM KOH; 19 සිට 21 මිනිත්තු, 100 mM KOH; 21 සිට 21.5 මිනිත්තු, 100 සිට 10 mM KOH. තීරුව විනාඩි 8.5 ක් සඳහා 10 mM KOH යටතේ නැවත සමතුලිත කරන ලදී.
තීරුවෙන් පසු ඉවත් කරන ලද පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය 150μl/min අයිසොප්‍රොපනෝල් අතිරේක ප්‍රවාහයක් සමඟ ඒකාබද්ධ කර සෘණ අයනීකරණ ආකාරයෙන් ක්‍රියාත්මක වන ඉහළ විභේදන ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයකට යොමු කෙරේ. MS විසින් 60,000 විභේදනයකින් m/z 50 සිට 750 දක්වා ස්කන්ධ පරාසය නිරීක්ෂණය කරයි. AGC 1×106 ලෙස සකසා ඇති අතර උපරිම අයන කාලය 100 ms හි තබා ඇත. රත් වූ ESI ප්‍රභවය 3.5 kV ඉසින වෝල්ටීයතාවයකින් ක්‍රියාත්මක විය. අයන ප්‍රභවයේ අනෙකුත් සැකසුම් පහත පරිදි වේ: කේශනාලිකා උෂ්ණත්වය 275°C; කොපු වායු ප්‍රවාහය, 60 AU; සහායක වායු ප්‍රවාහය, 300°C දී 20 AU සහ S කාච සැකසුම 60 AU දක්වා.
13C ලේබල් කරන ලද පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍යවල දත්ත විශ්ලේෂණය. සමස්ථානික අනුපාතය පිළිබඳ දත්ත විශ්ලේෂණය සඳහා TraceFinder මෘදුකාංගය (අනුවාදය 4.2, Thermo Fisher Scientific) භාවිතා කරන්න. සෑම සංයෝගයකම අනන්‍යතාවය විශ්වාසදායක යොමු සංයෝගයක් මගින් සත්‍යාපනය කර ස්වාධීනව විශ්ලේෂණය කරන ලදී. සමස්ථානික පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය සිදු කිරීම සඳහා, එක් එක් 13C සමස්ථානිකයේ (Mn) නිස්සාරණය කරන ලද අයන වර්ණදේහයේ (XIC) ප්‍රදේශය [M + H] + වෙතින් නිස්සාරණය කරන ලදී, එහිදී n යනු ඉලක්කගත සංයෝගයේ කාබන් අංකය වන අතර, ඇමයිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය කිරීමට භාවිතා කරයි හෝ [MH] + ඇනායන විශ්ලේෂණය කිරීමට භාවිතා කරයි. XIC හි ස්කන්ධ නිරවද්‍යතාවය මිලියනයකට කොටස් පහකට වඩා අඩු වන අතර RT හි නිරවද්‍යතාවය මිනිත්තු 0.05 කි. එක් එක් අනාවරණය කරගත් සමස්ථානිකයේ අනුපාතය අනුරූප සංයෝගයේ සියලුම සමස්ථානිකවල එකතුවට ගණනය කිරීමෙන් පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය සිදු කෙරේ. මෙම අනුපාත එක් එක් සමස්ථානිකය සඳහා ප්‍රතිශත අගයන් ලෙස ලබා දී ඇති අතර, ප්‍රතිඵල කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි මවුලික ප්‍රතිශත පොහොසත් කිරීම (MPE) ලෙස ප්‍රකාශ කෙරේ (42).
ශීත කළ නියුරෝන පෙති අයිස්-සීතල 80% මෙතනෝල් (v/v) තුළ සමජාතීය කර, සුළි සුළඟට දමා, -20°C දී විනාඩි 30ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. නියැදිය නැවත සුළි සුළඟට දමා +4°C දී විනාඩි 30ක් කලවම් කරන්න. නියැදිය 4°C දී මිනිත්තු 5ක් 21,000 g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කර, පසුව ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබුණු සුපිරි ද්‍රව්‍ය එකතු කර 25°C දී SpeedVac සාන්ද්‍රකයක් භාවිතයෙන් පසු විශ්ලේෂණය සඳහා වියළන ලදී. ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි, වර්ග කළ සෛලවල ඇමයිනෝ අම්ල මත LC-MS විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. TraceFinder (අනුවාදය 4.2, Thermo Fisher Scientific) භාවිතා කරමින්, එක් එක් සංයෝගයේ මොනොසයිටොපික් ස්කන්ධය භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. පූර්ව සැකසුම් මූලික මෘදුකාංග පැකේජය භාවිතයෙන් පරිවෘත්තීය දත්ත ප්‍රමාණාත්මක සාමාන්‍යකරණය සිදු කරන ලදී (57).
පෙති සකස් කිරීම. මූසිකය ඉක්මනින් කාබන් ඩයොක්සයිඩ් සමඟ නිර්වින්දනය කර හිස කපා දමන ලදී, මොළය ඉක්මනින් හිස් කබලෙන් ඉවත් කරන ලදී, සහ අයිස් පිරවූ කම්පන පිහිය (HM-650 V, තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්, වෝල්ඩෝෆ්, ජර්මනිය) භාවිතා කර එය 300 සිට 375 μm සැජිටල් කොටස් වලට කපා ඇත. සීතල කාබන් වායුකරණය (95% O2 සහ 5% CO2) අඩු Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ග්ලූකෝස්, 1.0 mM CaCl2 සහ 6.0 mM MgCl2 pH අගය 7.4 සහ 310 සිට 330 mOsm දක්වා සකසන්න). ලබාගත් මොළයේ පෙති ඉහළ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ග්ලූකෝස්, 4.0 mM CaCl2 සහ mM 3.5 MgCl2) pH අගය 7.4 සහ 310 සිට 320 mOsm) අඩංගු කුටියකට මාරු කරන්න. පටිගත කිරීමට පෙර ඒවා යථා තත්ත්වයට පත් කළ හැකි වන පරිදි පෙති විනාඩි 20 සිට 30 දක්වා ගබඩා කරන්න.
පටිගත කිරීම. සියලුම පටිගත කිරීම් සඳහා ස්ථාවර පටිගත කිරීමේ කුටියක් සහ 20x ජල ගිල්වීමේ වෛෂයික කාචයක් (Scientifica) සහිත අන්වීක්ෂීය අවධියක් භාවිතා කරන ලදී. පුර්කින්ජේ සෛල හඳුනාගනු ලැබුවේ (i) ශරීර ප්‍රමාණය, (ii) මස්තිෂ්කයේ ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක පිහිටීම සහ (iii) ප්‍රතිදීප්ත mtYFP වාර්තාකරු ජානයේ ප්‍රකාශනය මගිනි. මෙගෝහම් 5 සිට 11 දක්වා ඉඟි ප්‍රතිරෝධයක් සහිත පැච් පයිප්පය බෝරෝසිලිකේට් වීදුරු කේශනාලිකා (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, විද්‍යා නිෂ්පාදන, හොෆ්හයිම්, ජර්මනිය) සහ තිරස් පයිප්ප උපකරණ (P-1000, සූටර්), නොවාටෝ, CA) මගින් පිටතට ඇද දමනු ලැබේ. සියලුම පටිගත කිරීම් සිදු කරන ලද්දේ ELC-03XS npi පැච් කලම්ප ඇම්ප්ලිෆයර් (npi ඉලෙක්ට්‍රොනික GmbH, Tam, ජර්මනිය) විසිනි, එය සිග්නල් මෘදුකාංගය (අනුවාදය 6.0, කේම්බ්‍රිජ් ඉලෙක්ට්‍රොනික්, කේම්බ්‍රිජ්, එක්සත් රාජධානිය) මගින් පාලනය කරන ලදී. අත්හදා බැලීම 12.5 kHz නියැදි අනුපාතයකින් වාර්තා කරන ලදී. සංඥාව පිළිවෙලින් 1.3 සහ 10 kHz ක කැපුම් සංඛ්‍යාත සහිත කෙටි-පාස් බෙසල් පෙරහන් දෙකකින් පෙරහන් කරනු ලැබේ. පටලයේ සහ පයිප්පයේ ධාරිතාව ඇම්ප්ලිෆයර් භාවිතා කරන වන්දි පරිපථය මගින් වන්දි ලබා දෙනු ලැබේ. සියලුම අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලද්දේ හොකාවෝ මෘදුකාංගය (අනුවාදය 2.8, හමාමාට්සු, ගර්ඩන්, ජර්මනිය) මගින් පාලනය කරන ලද ඕර්කා-ෆ්ලෑෂ් 4.0 කැමරාවක (හමාමාට්සු, ගර්ඩන්, ජර්මනිය) පාලනය යටතේ ය.
සාමාන්‍ය සම්පූර්ණ සෛල වින්‍යාසය සහ විශ්ලේෂණය. පටිගත කිරීමට පෙර වහාම, පහත සඳහන් ද්‍රව්‍ය අඩංගු අභ්‍යන්තර ද්‍රාවණයෙන් පයිප්පය පුරවන්න: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM පොටෑසියම් ග්ලූකෝනේට්, 10.0 mM හෙප්ස්, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM ගුවානොසීන් ට්‍රයිපොස්පේට් (GTP) (Na) සහ 10.0 mM ක්‍රියේටිනින් පොස්පේට් pH අගය 7.25 දක්වා සකස් කරන ලද අතර, ඔස්මොටික් පීඩනය 290 mOsm (සුක්‍රෝස්) විය. පටලය කැඩීම සඳහා 0 pA බලයක් යෙදීමෙන් පසු, විවේක පටල විභවය මනිනු ලැබේ. ආදාන ප්‍රතිරෝධය මනිනු ලබන්නේ -40, -30, -20 සහ -10 pA අධිධ්‍රැවීකරණය වූ ධාරා යෙදීමෙනි. වෝල්ටීයතා ප්‍රතිචාරයේ විශාලත්වය මැන බලා ආදාන ප්‍රතිරෝධය ගණනය කිරීමට ඕම් නියමය භාවිතා කරන්න. ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරිත්වය මිනිත්තු 5 ක් සඳහා වෝල්ටීයතා කලම්පයක වාර්තා කරන ලද අතර, අර්ධ ස්වයංක්‍රීය හඳුනාගැනීමේ ස්ක්‍රිප්ට් එකක් භාවිතයෙන් sPSC හඳුනාගෙන Igor Pro (අනුවාදය 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) හි මනිනු ලැබීය. IV වක්‍රය සහ ස්ථාවර-තත්ව ධාරාව මනිනු ලබන්නේ විවිධ විභවයන්හිදී (-110 mV සිට ආරම්භ වන) බැටරිය තද කිරීමෙන් සහ 5 mV පියවර වලින් වෝල්ටීයතාව වැඩි කිරීමෙනි. විධ්‍රැවීකරණ ධාරාවක් යෙදීමෙන් AP නිෂ්පාදනය පරීක්ෂා කරන ලදී. විධ්‍රැවීකරණ ධාරා ස්පන්දනයක් යොදන අතරතුර සෛලය -70 mV හි කලම්ප කරන්න. එක් එක් පටිගත කිරීමේ ඒකකයේ පියවර ප්‍රමාණය වෙන වෙනම සකසන්න (10 සිට 60 pA දක්වා). ඉහළම AP සංඛ්‍යාතයට හේතු වන ස්පන්දන කරල් අතින් ගණනය කිරීමෙන් උපරිම AP සංඛ්‍යාතය ගණනය කරන්න. පළමුව AP එකක් හෝ කිහිපයක් අවුලුවන විධ්‍රැවීකරණ ස්පන්දනයේ දෙවන ව්‍යුත්පන්නය භාවිතා කිරීමෙන් AP එළිපත්ත විශ්ලේෂණය කෙරේ.
සිදුරු සහිත පැච් වින්‍යාසය සහ විශ්ලේෂණය. සම්මත ප්‍රොටෝකෝල භාවිතයෙන් සිදුරු සහිත පැච් පටිගත කිරීම සිදු කරන්න. පහත සඳහන් අමුද්‍රව්‍ය අඩංගු නොවන ATP- සහ GTP-නිදහස් පයිප්පයක් භාවිතා කරන්න: 128 mM ග්ලූකෝනේට් K, 10 mM KCl, 10 mM හෙප්ස්, 0.1 mM EGTA සහ 2 mM MgCl2, සහ pH 7.2 ට සකසන්න (KOH භාවිතා කරමින්). සෛල පටලයේ පාලනයකින් තොරව පාරගම්ය වීම වැළැක්වීම සඳහා ATP සහ GTP අන්තර් සෛලීය ද්‍රාවණයෙන් ඉවත් කර ඇත. සිදුරු කරන ලද පැච් වාර්තාවක් ලබා ගැනීම සඳහා පැච් පයිප්පය ඇම්ෆොටෙරිසින් අඩංගු අභ්‍යන්තර ද්‍රාවණයකින් (ආසන්න වශයෙන් 200 සිට 250μg/ml; G4888, සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) පුරවා ඇත. ඇම්ෆොටෙරිසින් ඩයිමෙතිල් සල්ෆොක්සයිඩ්වල විසුරුවා හරින ලදී (අවසාන සාන්ද්‍රණය: 0.1 සිට 0.3% දක්වා; DMSO; D8418, සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්). භාවිතා කරන ලද DMSO සාන්ද්‍රණය අධ්‍යයනය කරන ලද නියුරෝන කෙරෙහි සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කළේ නැත. සිදුරු කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, නාලිකා ප්‍රතිරෝධය (Ra) අඛණ්ඩව නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, Ra සහ AP හි විස්තාරය ස්ථාවර වූ පසු (මිනිත්තු 20-40) අත්හදා බැලීම ආරම්භ කරන ලදී. ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරිත්වය වෝල්ටීයතාවයක් සහ/හෝ ධාරා කලම්පයකින් මිනිත්තු 2 සිට 5 දක්වා මනිනු ලැබේ. Igor Pro (අනුවාදය 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (අනුවාදය 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) සහ GraphPad Prism (අනුවාදය 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. ස්වයංසිද්ධ AP හඳුනා ගැනීම සඳහා, IgorPro හි NeuroMatic v3.0c ප්ලග්-ඉන් භාවිතා වේ. එක් එක් වාර්තාව සඳහා තනි තනිව සකස් කරන ලද දී ඇති සීමාවක් භාවිතයෙන් AP ස්වයංක්‍රීයව හඳුනා ගන්න. ස්පයික් පරතරය භාවිතා කරමින්, උපරිම ක්ෂණික ස්පයික් සංඛ්‍යාතය සහ සාමාන්‍ය ස්පයික් සංඛ්‍යාතය සමඟ ස්පයික් සංඛ්‍යාතය තීරණය කරන්න.
PN හුදකලා කිරීම. කලින් ප්‍රකාශයට පත් කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයට අනුවර්තනය වීමෙන්, නිශ්චිත අවධියකදී (58) මී මස්තිෂ්කයෙන් PN පිරිසිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, මස්තිෂ්කය විච්ඡේදනය කර අයිස්-සීතල විඝටන මාධ්‍යයෙන් අඹරන ලදී [HBSS Ca2+ සහ Mg2+ නොමැතිව, 20 mM ග්ලූකෝස්, පෙනිසිලින් (50 U/ml) සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (0.05 mg/ml) සමඟ පරිපූරණය කරන ලදී], පසුව පැපේන් [HBSS, 1-සිස්ටීන්·HCl (1 mg/ml (1 mg/ml), පැපේන් (16 U/ml) සහ ඩිඔක්සිරයිබොනියුක්ලීස් I (DNase I; 0.1 mg/ml) සමඟ පරිපූරණය කරන ලදී] 30°C දී මිනිත්තු 30ක් ප්‍රතිකාර කරන්න. පළමුව එන්සයිම ජීර්ණය වැළැක්වීම සඳහා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී බිත්තර ශ්ලේෂ්මල (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) සහ DNase (0.1 mg/ml) අඩංගු HBSS මාධ්‍යයෙන් පටක සෝදන්න, පසුව 20 mM ග්ලූකෝස් අඩංගු HBSS මාධ්‍යයෙන් මෘදු ලෙස ඇඹරීම, පෙනිසිලින් (50 U/ml), ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (0.05 mg/ml) සහ DNase (0.1 mg/ml) තනි සෛල මුදා හැරීම. ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සෛල අත්හිටුවීම 70μm සෛල පෙරනයක් හරහා පෙරීම සිදු කරන ලදී, පසුව සෛල කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය (1110 rpm, මිනිත්තු 5, 4°C) මගින් පෙති කර වර්ග කිරීමේ මාධ්‍යයේ නැවත අත්හිටුවන ලදී [HBSS, 20 mM ග්ලූකෝස් සමඟ අතිරේකව, 20% භ්‍රෑණ ගව) සෙරුමය, පෙනිසිලින් (50 U/ml) සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (0.05 mg/ml)]; ප්‍රොපිඩියම් අයඩයිඩ් සමඟ සෛල ශක්‍යතාව තක්සේරු කර සෛල ඝනත්වය 1×106 සිට 2×106 සෛල/ml දක්වා සකසන්න. ප්‍රවාහ සයිටෝමෙට්‍රියට පෙර, අත්හිටුවීම 50 μm සෛල පෙරනයක් හරහා පෙරන ලදී.
ප්‍රවාහ සයිටෝමීටරය. FACSAria III යන්ත්‍රය (BD Biosciences) සහ FACSDiva මෘදුකාංගය (BD Biosciences, අනුවාදය 8.0.1) භාවිතයෙන් සෛල වර්ග කිරීම 4°C දී සිදු කරන ලදී. සෛල අත්හිටුවීම ~2800 සිදුවීම්/තත්පර අනුපාතයකින් 20 psi පීඩනයක් යටතේ 100 μm තුණ්ඩයක් භාවිතයෙන් වර්ග කරන ලදී. සාම්ප්‍රදායික ගේටින් නිර්ණායක (සෛල ප්‍රමාණය, ද්විමාන වෙනස්කම් කිරීම සහ විසිරුම් ලක්ෂණ) අනෙකුත් සෛල වර්ග වලින් PN නිවැරදි හුදකලාව සහතික කළ නොහැකි බැවින්, mitoYFP+ ​​සහ පාලන mitoYFP − මීයන් තුළ YFP තීව්‍රතාවය සහ ස්වයංක්‍රීය ප්‍රතිදීප්තතාවයේ සෘජු සංසන්දනය මත පදනම්ව ගේටින් උපාය මාර්ගය සකසා ඇත. 488 nm ලේසර් රේඛාවක් සමඟ නියැදිය විකිරණය කිරීමෙන් YFP උද්යෝගිමත් වන අතර, සංඥාව 530/30 nm කලාප පාස් පෙරහනක් භාවිතයෙන් අනාවරණය වේ. mitoYFP+ ​​මීයන් තුළ, Rosa26-mitoYFP වාර්තාකරු ජානයේ සාපේක්ෂ ශක්තිය ස්නායු ශරීරය සහ අක්ෂ කොටස් වෙන්කර හඳුනා ගැනීමට ද භාවිතා වේ. 7-AAD 561 nm කහ ලේසර් එකකින් උද්දීපනය කර මිය ගිය සෛල බැහැර කිරීම සඳහා 675/20 nm බෑන්ඩ්පාස් පෙරහනකින් අනාවරණය කර ඇත. ඒ සමඟම තාරකා සෛල වෙන් කිරීම සඳහා, සෛල අත්හිටුවීම ACSA-2-APC සමඟ පැල්ලම් කරන ලදී, පසුව නියැදිය 640 nm ලේසර් රේඛාවකින් විකිරණය කරන ලද අතර, සංඥාව හඳුනා ගැනීම සඳහා 660/20 nm බෑන්ඩ්පාස් පෙරහනක් භාවිතා කරන ලදී.
එකතු කරන ලද සෛල කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය (1110 rpm, මිනිත්තු 5, 4°C) මගින් පෙති කරන ලද අතර භාවිතය තෙක් -80°C හි ගබඩා කරන ලදී. ක්‍රියා පටිපාටි විචල්‍යතාවය අවම කිරීම සඳහා Mfn2cKO මීයන් සහ ඔවුන්ගේ පැටවුන් එකම දිනයේ වර්ගීකරණය කර ඇත. FlowJo මෘදුකාංගය (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) භාවිතයෙන් FACS දත්ත ඉදිරිපත් කිරීම සහ විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
ඉහත සඳහන් කළ පරිදි (59), තත්‍ය කාලීන PCR භාවිතා කරනුයේ පසුකාලීන mtDNA ප්‍රමාණනය සඳහා වර්ග කරන ලද නියුරෝන වලින් DNA හුදකලා කිරීමට ය. රේඛීයතාව සහ එළිපත්ත සංවේදීතාව මුලින් පරීක්ෂා කරන ලද්දේ විවිධ සෛල සංඛ්‍යාවක් මත qPCR ක්‍රියාත්මක කිරීමෙනි. කෙටියෙන් කිවහොත්, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 සහ ප්‍රෝටීනේස් K (200 ng/ml) වලින් සමන්විත ලයිසිස් බෆරයක PN 300 ක් එකතු කර 55°C විනාඩි 120 කින් ඉන්කියුබේට් කරන්න. ප්‍රෝටීනේස් K සම්පූර්ණයෙන් අක්‍රිය කිරීම සහතික කිරීම සඳහා සෛල 95°C දී මිනිත්තු 10 ක් තවදුරටත් ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. mt-Nd1 සඳහා විශේෂිත වූ TaqMan පරීක්ෂණයක් (Thermo Fisher) භාවිතා කරමින්, mtDNA 7900HT තත්‍ය කාලීන PCR පද්ධතියේ (Thermo Fisher Scientific) අර්ධ ප්‍රමාණාත්මක PCR මගින් මනිනු ලැබීය. විද්‍යාව, නාමාවලි අංකය Mm04225274_s1), mt-Nd6 (තාප ෆිෂර් විද්‍යාත්මක, නාමාවලි අංකය AIVI3E8) සහ 18S (තාප ෆිෂර් විද්‍යාත්මක, නාමාවලි අංකය Hs99999901_s1) ජාන.
ප්‍රෝටියෝම් සාම්පල සකස් කිරීම. ද්‍රාවණය 95°C දී විනාඩි 10ක් රත් කර සොනිකේට් කිරීමෙන්, ලිසිස් බෆරයේ [6 M ගුවානයිඩින් ක්ලෝරයිඩ්, 10 mM ට්‍රයිස්(2-කාබොක්සිඑතිල්) පොස්පයින් හයිඩ්‍රොක්ලෝරයිඩ්, 10 mM ක්ලෝරෝඇසිටමයිඩ් සහ 100 mM ට්‍රයිස්-ලයිස් ශීත කළ නියුරෝන පෙති HCl හි]. බයෝරප්ටර් (ඩයජෙනෝඩය) මත මිනිත්තු 10ක් (තත්පර 30 ස්පන්දනය / තත්පර 30 විරාම කාලය). නියැදිය 20 mM ට්‍රයිස්-HCl (pH 8.0) හි 1:10 ට තනුක කර, 300 ng ට්‍රිප්සින් රන් (ප්‍රොමේගා) සමඟ මිශ්‍ර කර, සම්පූර්ණ ජීර්ණය ලබා ගැනීම සඳහා එක රැයකින් 37°C දී ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. දෙවන දිනයේදී, නියැදිය විනාඩි 20ක් සඳහා ග්‍රෑම් 20,000 ට කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. සුපර්නේටන්ට් 0.1% ෆෝමික් අම්ලය සමඟ තනුක කරන ලද අතර, ද්‍රාවණය ස්වයං-සාදන ලද ස්ටේජ්ටිප්ස් සමඟ ලුණු ඉවත් කරන ලදී. නියැදිය 45°C දී SpeedVac උපකරණයක (Eppendorf සාන්ද්‍රකය සහ 5305) වියළන ලද අතර, පසුව පෙප්ටයිඩය 0.1% ෆෝමික් අම්ලයේ අත්හිටුවන ලදී. සියලුම සාම්පල එකම පුද්ගලයා විසින් එකවර සකස් කරන ලදී. තාරකා සෛල සාම්පල විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, 4 μg ලුණු දැමූ පෙප්ටයිඩ 1:20 පෙප්ටයිඩයට TMT ප්‍රතික්‍රියාකාරක අනුපාතයක් සහිත ටැන්ඩම් ස්කන්ධ ටැගයකින් (TMT10plex, නාමාවලි අංකය 90110, Thermo Fisher Scientific) ලේබල් කරන ලදී. TMT ලේබල් කිරීම සඳහා, TMT ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ 0.8 mg නිර්ජලීය ACN 70 μl තුළ නැවත සකස් කරන ලද අතර, වියළන ලද පෙප්ටයිඩය 0.1 M TEAB (ට්‍රයිඑතිලමෝනියම් බයිකාබනේට්) හි 9 μl බවට නැවත සකස් කරන ලද අතර, එයට ACN හි TMT ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ 7 μl එකතු කරන ලදී. සාන්ද්‍රණය 43.75% කි. මිනිත්තු 60 ක ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු, ප්‍රතික්‍රියාව 5% හයිඩ්‍රොක්සිලමයින් 2 μl සමඟ නිවා දමන ලදී. ලේබල් කරන ලද පෙප්ටයිඩ එකතු කර, වියළා, 0.1% ෆෝමික් අම්ලයේ (FA) 200μl ට නැවත අසුරා, දෙකකට බෙදා, පසුව ස්වයං-සාදන ලද StageTips භාවිතයෙන් ලුණු ඉවත් කරන ලදී. UltiMate 3000 අතිශය ඉහළ කාර්යසාධනයක් සහිත ද්‍රව වර්ණදේහය (UltiMate 3000 අතිශය ඉහළ කාර්යසාධනයක් සහිත ද්‍රව වර්ණදේහය) භාවිතා කරමින්, අර්ධ දෙකෙන් එකක් 130Å1.7μm C18 අංශු වලින් පුරවා ඇති 1mm x 150mm Acquity වර්ණදේහ තීරුවක් මත ඛණ්ඩනය කරන ලදී (Waters, නාමාවලිය අංක SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). 30μl/min ප්‍රවාහ අනුපාතයකින් පෙප්ටයිඩ වෙන් කරන්න, 1% සිට 50% දක්වා බෆර් B සිට විනාඩි 85 ක් සඳහා විනාඩි 96 ක පියවරෙන් පියවර අනුක්‍රමණයකින්, 50% සිට 95% දක්වා බෆර් B දක්වා විනාඩි 3 ක්, පසුව 95% බෆර් B සඳහා විනාඩි 8 ක්; බෆරය A 5% ACN සහ 10 mM ඇමෝනියම් බයිකාබනේට් (ABC) වන අතර, බෆරය B 80% ACN සහ 10 mM ABC වේ. සෑම මිනිත්තු 3 කට වරක් භාග එකතු කර ඒවා කාණ්ඩ දෙකකට ඒකාබද්ධ කරන්න (1 + 17, 2 + 18, ආදිය) සහ රික්ත කේන්ද්‍රාපසාරී යන්ත්‍රයක වියළන්න.
LC-MS/MS විශ්ලේෂණය. ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය සඳහා, පෙප්ටයිඩ (අංකය r119.aq) 25 cm, 75 μm අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භයක් සහිත PicoFrit විශ්ලේෂණ තීරුවක් (නව වෛෂයික කාචය, කොටස් අංකය PF7508250) මත වෙන් කරන ලදී. 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ මාධ්‍යයකින් (ආචාර්ය Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany) සමන්විත විය. තීරුව 50°C දී පවත්වා ගෙන යන ලදී. බෆර A සහ ​​B පිළිවෙලින් ජලයේ 0.1% ෆෝමික් අම්ලය සහ 80% ACN හි 0.1% ෆෝමික් අම්ලය වේ. පෙප්ටයිඩ විනාඩි 65 ක් සඳහා 6% සිට 31% දක්වා බෆර් B සහ විනාඩි 5 ක් සඳහා 31% සිට 50% දක්වා බෆර් B වෙන් කරන ලදී. 200 nl/min අනුක්‍රමණයකින්. ඕර්බිට්‍රැප් විලයන ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් (තර්මෝ ෆිෂර් සයන්ටිෆික්) මත ඉවත් කරන ලද පෙප්ටයිඩ විශ්ලේෂණය කරන ලදී. පෙප්ටයිඩ පූර්වගාමියා m/z මැනීම 350 සිට 1500 m/z පරාසයේ 120,000 විභේදනයකින් සිදු කෙරේ. 27% සාමාන්‍යකරණය කළ ඝට්ටන ශක්තිය භාවිතා කරමින්, 2 සිට 6 දක්වා ආරෝපණ තත්වයක් සහිත ශක්තිමත්ම පූර්වගාමියා ඉහළ ශක්ති C උගුල් විඝටනය (HCD) බෙදීම සඳහා තෝරා ගනු ලැබේ. චක්‍ර කාලය තත්පර 1 දක්වා සකසා ඇත. පෙප්ටයිඩ කොටසෙහි m/z අගය අයන උගුල තුළ 5×104 කුඩාම AGC ඉලක්කය සහ 86 ms උපරිම එන්නත් කාලය භාවිතා කරමින් මනිනු ලැබීය. ඛණ්ඩනය කිරීමෙන් පසු, පූර්වගාමියා තත්පර 45 ක් සඳහා ගතික බැහැර කිරීමේ ලැයිස්තුවේ තබා ඇත. TMT-ලේබල් කරන ලද පෙප්ටයිඩ 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap තීරුවක් මත වෙන් කරන ලදී (Thermo Fisher Scientific, නාමාවලි අංකය 164942), සහ සංක්‍රමණ වර්ණාවලීක්ෂය ඉහළ ක්ෂේත්‍ර අසමමිතික තරංග ආකෘති අයන (FAIMS) උපකරණ (Thermo Fisher Scientific) වලින් සමන්විත Orbitrap Lumos Tribrid ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් (Thermo Fisher Scientific) මත විශ්ලේෂණය කරන ලදී. −50 සහ −70 V වන්දි වෝල්ටීයතා දෙකකින් ක්‍රියාත්මක වේ. සමමුහුර්ත කිරීමේ පූර්වගාමියා මත පදනම්ව තෝරාගත් MS3 TMT වාර්තා අයන සංඥා මැනීම සඳහා භාවිතා වේ. පෙප්ටයිඩ වෙන් කිරීම EASY-nLC 1200 මත සිදු කරන ලදී, 90% රේඛීය අනුක්‍රමික ඉවත් කිරීමක් භාවිතා කරමින්, 6% සිට 31% දක්වා බෆර සාන්ද්‍රණයක් සහිතව; බෆරය A 0.1% FA වූ අතර බෆරය B 0.1% FA සහ 80% ACN විය. විශ්ලේෂණාත්මක තීරුව 50°C දී ක්‍රියාත්මක වේ. FAIMS වන්දි වෝල්ටීයතාවයට අනුව මුල් ගොනුව බෙදීමට FreeStyle (අනුවාදය 1.6, Thermo Fisher Scientific) භාවිතා කරන්න.
ප්‍රෝටීන් හඳුනා ගැනීම සහ ප්‍රමාණනය. ඒකාබද්ධ ඇන්ඩ්‍රොමීඩා සෙවුම් යන්ත්‍රය භාවිතා කරමින්, මුල් දත්ත MaxQuant අනුවාදය 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. Aequorea victoria වෙතින් ලබාගත් Cre recombinase සහ YFP අනුපිළිවෙලට අමතරව, පෙප්ටයිඩ කොටස් වර්ණාවලීක්ෂය මූසික යොමු ප්‍රෝටියෝමයේ කැනොනිකල් අනුක්‍රමය සහ අයිසෝෆෝම් අනුක්‍රමය සඳහා සෙවීය (ප්‍රෝටියෝම් ID UP000000589, 2017 මැයි මාසයේදී UniProt වෙතින් බාගත කරන ලදී). මෙතියොනීන් ඔක්සිකරණය සහ ප්‍රෝටීන් N-පර්යන්ත ඇසිටිලේෂන් විචල්‍ය වෙනස් කිරීම් ලෙස සකසා ඇත; සිස්ටීන් කාබමොයිල් මෙතිලේෂන් ස්ථාවර වෙනස් කිරීම් ලෙස සකසා ඇත. ජීර්ණ පරාමිතීන් "විශේෂත්වය" සහ "ට්‍රිප්සින්/P" ලෙස සකසා ඇත. ප්‍රෝටීන් හඳුනා ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන අවම පෙප්ටයිඩ සහ රේසර් පෙප්ටයිඩ ගණන 1 කි; අද්විතීය පෙප්ටයිඩ ගණන 0 කි. පෙප්ටයිඩ සිතියම් ගැලපීමේ කොන්දේසි යටතේ, ප්‍රෝටීන් හඳුනාගැනීමේ අනුපාතය 0.01 කි. "දෙවන පෙප්ටයිඩ්" විකල්පය සක්‍රීය කර ඇත. විවිධ මුල් ගොනු අතර සාර්ථක හඳුනාගැනීම් මාරු කිරීමට “ධාවන අතර ගැලපීම” විකල්පය භාවිතා කරන්න. ලේබල්-නිදහස් ප්‍රමාණකරණය (LFQ) සඳහා LFQ අවම අනුපාත ගණන 1 භාවිතා කරන්න (60). සෑම කාල ලක්ෂ්‍යයකම අවම වශයෙන් එක් ප්‍රවේණික කාණ්ඩයක අවම වශයෙන් වලංගු අගයන් දෙකක් සඳහා LFQ තීව්‍රතාවය පෙරහන් කර ඇති අතර, පළලක් සහිත සාමාන්‍ය ව්‍යාප්තියකින් උපුටා ගන්නා ලදී. 0.3 සහ පහළට 1.8. LFQ ප්‍රතිඵල විශ්ලේෂණය කිරීමට Perseus පරිගණක වේදිකාව (https://maxquant.net/perseus/) සහ R (https://r-project.org/) භාවිතා කරන්න. අවකල ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය සඳහා limma මෘදුකාංග පැකේජයෙන් ද්වි-මාර්ග මධ්‍යස්ථ t පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරන ලදී (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally සහ pheatmap භාවිතයෙන් ගවේෂණාත්මක දත්ත විශ්ලේෂණය සිදු කරනු ලැබේ. TMT මත පදනම් වූ ප්‍රෝටියොමික්ස් දත්ත MaxQuant අනුවාදය 1.6.10.43 භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. 2018 සැප්තැම්බර් මාසයේදී බාගත කරන ලද UniProt හි මානව ප්‍රෝටෝමික්ස් දත්ත සමුදායෙන් අමු ප්‍රෝටෝමික්ස් දත්ත සොයන්න. විශ්ලේෂණයට නිෂ්පාදකයා විසින් සපයන ලද සමස්ථානික සංශුද්ධතාවය නිවැරදි කිරීමේ සාධකය ඇතුළත් වේ. අවකල ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය සඳහා R හි limma භාවිතා කරන්න. මුල් දත්ත, දත්ත සමුදා සෙවුම් ප්‍රතිඵල සහ දත්ත විශ්ලේෂණ වැඩ ප්‍රවාහය සහ ප්‍රතිඵල සියල්ල PRIDE හවුල්කාර ගබඩාව හරහා PXD019690 දත්ත කට්ටල හඳුනාගැනීම සමඟ ProteomeXchange සන්ධානය තුළ ගබඩා කර ඇත.
ක්‍රියාකාරී විවරණ විශ්ලේෂණය පොහොසත් කරයි. සති 8 දී දත්ත කට්ටලයේ ක්‍රියාකාරී විවරණ පදවල පොහොසත්කම තීරණය කිරීම සඳහා Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) මෙවලම භාවිතා කරන ලදී (රූපය 1). කෙටියෙන් කිවහොත්, LC-MS/MS (ටැන්ඩම් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය) දත්ත විශ්ලේෂණයෙන් ලබාගත් ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රෝටීන් ලැයිස්තුව පහත පෙරහන් නිර්ණායක සමඟ භාවිතා වේ: මස් මාංශ පේශි විශේෂය සහ පසුබිම ලෙස තෝරාගෙන ඇති අතර, කාණ්ඩය මඟින් බෙන්ජමිනි විසින් 0.05 හෝ ඊට අඩු පොහොසත් කිරීම සඳහා සකස් කරන ලද P අගය සැලකිය යුතු ලෙස සලකනු ලැබේ. මෙම ප්‍රස්ථාරය සඳහා, සකස් කරන ලද P අගය මත පදනම්ව එක් එක් පොකුරේ ඉහළම අතිරික්ත කාණ්ඩ පහ පෙන්වනු ලැබේ. බහු t-පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරමින්, බෙන්ජමිනි, ක්‍රීගර් සහ යෙකුටියෙලි (Q = 5%) හි අදියර දෙකක රේඛීය බූස්ට් වැඩසටහන භාවිතා කරමින්, එක් එක් කාණ්ඩයේ හඳුනාගත් වැදගත් අපේක්ෂකයින් මත කාල-පාඨමාලා ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය සිදු කරනු ලබන අතර, සෑම පේළියක්ම වෙන වෙනම විශ්ලේෂණය කරනු ලැබේ. ස්ථාවර SD එකක් අනුගමනය කිරීමට අවශ්‍ය නැත.
මෙම අධ්‍යයනයේ ප්‍රතිඵල ප්‍රකාශිත දත්ත සමුදායන් සමඟ සංසන්දනය කිරීම සහ රූප සටහන 1 හි වෙන් රූප සටහනක් ජනනය කිරීම සඳහා, අපි ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රෝටීන් ලැයිස්තුව MitoCarta 2.0 විවරණ සමඟ ඒකාබද්ධ කළෙමු (24). රූප සටහන ජනනය කිරීම සඳහා Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) මාර්ගගත මෙවලම භාවිතා කරන්න.
ප්‍රෝටියෝමික්ස් විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන සංඛ්‍යානමය ක්‍රියා පටිපාටි පිළිබඳ සවිස්තරාත්මක තොරතුරු සඳහා, කරුණාකර ද්‍රව්‍ය හා ක්‍රමවල අනුරූප කොටස බලන්න. අනෙකුත් සියලුම අත්හදා බැලීම් සඳහා, සවිස්තරාත්මක තොරතුරු අනුරූප පුරාවෘත්තයෙන් සොයාගත හැකිය. වෙනත් ආකාරයකින් නිශ්චිතව දක්වා නොමැති නම්, සියලුම දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SEM ලෙස ප්‍රකාශ කර ඇති අතර, සියලුම සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණ GraphPad Prism 8.1.2 මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.
මෙම ලිපිය සඳහා අතිරේක ද්‍රව්‍ය සඳහා, කරුණාකර http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 බලන්න.
මෙය Creative Commons Attribution-Non-Commercial බලපත්‍රයේ නියමයන් යටතේ බෙදා හරින ලද විවෘත ප්‍රවේශ ලිපියකි, එය අවසාන භාවිතය වාණිජමය වාසි සඳහා නොවන තාක් කල් සහ මුල් කෘතිය නිවැරදි බව උපකල්පනය කරන තාක් කල්, ඕනෑම මාධ්‍යයකින් භාවිතය, බෙදා හැරීම සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීමට ඉඩ සලසයි. යොමුව.
සටහන: අපි ඔබෙන් ඉල්ලා සිටින්නේ ඔබගේ විද්‍යුත් තැපැල් ලිපිනය ලබා දෙන ලෙසයි, එවිට ඔබ පිටුවට නිර්දේශ කරන පුද්ගලයාට ඔබට විද්‍යුත් තැපෑල දැකීමට අවශ්‍ය බවත් එය ස්පෑම් නොවන බවත් දැනගත හැකිය. අපි කිසිදු විද්‍යුත් තැපැල් ලිපිනයක් ග්‍රහණය නොකරමු.
ඔබ අමුත්තෙකු දැයි පරීක්ෂා කිරීමට සහ ස්වයංක්‍රීය ස්පෑම් ඉදිරිපත් කිරීම වැළැක්වීමට මෙම ප්‍රශ්නය භාවිතා කරයි.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G විසිනි. ලාර්සන්
අක්‍රිය ස්නායු වල ප්‍රෝටියොමික්ස් විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ ස්නායු පරිහානියට ප්‍රතිරෝධය දැක්වීම සඳහා පරිවෘත්තීය වැඩසටහන් සක්‍රීය කර ඇති බවයි.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G විසිනි. ලාර්සන්
අක්‍රිය ස්නායු වල ප්‍රෝටියොමික්ස් විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ ස්නායු පරිහානියට ප්‍රතිරෝධය දැක්වීම සඳහා පරිවෘත්තීය වැඩසටහන් සක්‍රීය කර ඇති බවයි.
©2020 විද්‍යාවේ දියුණුව සඳහා වූ ඇමරිකානු සංගමය. සියලු හිමිකම් ඇවිරිණි. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef සහ COUNTER හි හවුල්කරුවෙකි. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.